bob.com植物组织培养(全)

　　bob.com统计表明，通过花药培养获得单倍体的植物种类或品种较多；设备上要求简单。花粉培养有花药培养不能比拟的优点——完全排除了花药组织的干扰，避免花粉与花药组织的体细胞形成分裂和增殖的竞争，更有利于花粉植株的形成，所诱导形成的胚状体、愈伤组织及植株均来自花粉，可省略对其鉴定的程序；在诱导形成单倍体的同时，若结合突变体筛选和进行基因操作研究时，花粉培养更具优势。

　　将获得的无菌胚乳接种在MS分别添加BA 0．1、0．2、0-3 mg L。(单位下同)，2,4-D 1．0、2．0、3．0的诱导培养基中进行筛选。分为光培养和暗培养、胚乳表皮朝向培养基和胚乳表皮背向培养基、萌发前的胚乳和萌发后的胚乳进行愈伤组织诱导效果的比较研究。

　　叶片消毒、无菌水冲洗，去下表皮、4 cm见方小块、2克叶片，20 ml灭过菌的酶溶液、线次，进行培养

　　注意：大麦，小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离。（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间链状互锁结构）

　　缺点：一块外植体只能部分接触培养基，不能浸没在培养基中，结果培养物上下部因接受养分不匀而形成差异，不易使细胞群体保持一致。

　　液体培养基：提供比较均匀的营养，而且细胞的增殖速度快，一般用于细胞，原生质体的培养，也可用于愈伤组织的培养，胚状体等材料的继代培养。

　　30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。

　　1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来（1937），他用3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，取代酵母浸出液获得成功。此合成培养基后被称为White培养基。

　　琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸、过碱也会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。

　　优点：1. 控制杂种后代分离，缩短育种年限2. 提高获得纯合材料的效率3. 排除显隐性干扰，提高选择的准确性单倍体育种 AABB 杂交育种 A-B-4. 为研究细胞学、遗传学理论问题提供素材5. 单倍体植物的诱变育种6. 克服远缘杂种不孕性与不稳定的现象；

　　1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法。繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”。目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物（如甘蔗和草莓等）中，快繁也已达到了工厂化消生产规模，在若干作物中与通过整尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。

　　一般生根培养基中要完全去除或用很低的细胞分裂素。并加入适量的生长素，最常用的是NAA。一部分植物由于生长的嫩技本身含有丰富的生长素，因此也可以在无生长素的培养基上生根。

　　很多草本植物不定根的形成很容易，但木本一般较难，从成年树上得到的材料生根更难。对于这类生根较困难的植物，可试用以下几种方法：先用高浓度（100g／L左右）的生长素处理嫩茎几小时到一天，用无菌水冲洗后再接入到培养基中；如苹果、苹果砧木、梨等，可在生根培养基中加入适量的根皮苷或根皮酚以促进根的形成，浓度约为150mg／L。

　　（4）花：为聚伞花序，第一或第二花序开放，恰是块茎强盛膨大之时，此时是需要不断浇水的形态标志。

　　(5) 果实、种子：果实为球形或椭圆形浆果。种子小。扁平肾形。种子可用来繁殖，但后代性状分离大。

　　马铃薯性喜冷气候，不耐高温和霜冻，解除休眠的块茎4℃下发芽，发芽适温为12-18℃。地上茎叶生长温度为17-21℃，25℃以上时生长不良，叶变小，超过30℃和7℃以下茎叶停止生长，-1℃时受冻。块茎形成要求昼温14-24℃，夜温12-14℃，土温16-18℃。土温20℃以上时块茎形成缓慢，而且容易引起退化，高温下养分多用于芽和匍匐茎生长不易形成块茎，25-30℃时已经长成的块茎也变成细长茎，结薯期要求12h左右的短日照和疏松、湿润、肥沃以及通气良好的土壤条件。土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不整。

　　（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。

　　继代方法：用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。

　　根和地下部器官生长于土中消毒较为困难。除预先用自来水洗涤外，还应用软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。可采用0.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸钠溶液浸10～15min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。

　　受精极核进行核分裂后，即形成 细胞壁产生胚乳细胞。合瓣花类植物多是这类胚乳（如蕃茄、烟草）。

　　初生胚乳核的首次分裂伴随细胞质的分裂，将胚囊腔分隔为二，形成一大、一小两个细胞，大细胞位于珠孔端，小细胞位于合点端。前者可进行多次的游离核分裂，最后形成细胞。后者极少分裂或不分裂，呈合胞体状态。主要存在于单子叶植物沼生目，如泽泻、慈姑等。

　　我国在70年代用茎尖组织培养方法得到脱毒马铃薯试管苗，并成功地获得脱毒复壮的马铃薯，开始了脱毒种薯的生产和推广。八五期间，农业部在全国范围内设立了6个马铃薯原原种基地建设和种薯生产项目，初步形成了脱毒草种薯生产体系。共推广脱毒种薯36.5-40万公顷，获经济效益近30.8亿元。

　　将配制好的母液按顺序排列，先取适量的蒸馏水放入容器，然后依次用专用的移液管按需要量吸取各种母液，并混合在一起。再将琼脂（事先加热溶解）和糖加入其中，最后加蒸馏水定容至所需体积。随即用0.lmol/l的NaOH和HCl将pH调至所需的数值，然后分装到培养瓶中。

　　由于接种的植物材料的组成细胞通常都是成熟细胞，处在静止状态，一般不进行分裂。

　　诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况及外部因素而异。 菊芋1d，胡萝卜几天，

　　外源激素是愈伤组织诱导过程中不可缺少的组成成分，是一种诱导剂，能诱导细胞开始分裂，外源生长物质往往是通过调整它的种类和浓度来诱导细胞开始分裂的。最常用的有2，4－D、NAA、IAA和细胞分裂素等。2,4－D处理静止状态的组织时，细胞的RNA含量明显增加，而且2，4-D可积累在分裂细胞的核仁中。

　　原生质体的培养方法分为液体培养、琼脂糖包埋和看护培养几种方式。有些植物适于采用液体浅层培养, 另外, 固液双层培养法也被应用于原生质体再生。

　　原生质体的接种密度对培养效果影响很大。密度过小, 原生质体内含物外渗而引起褐变或进行一次分裂后即死亡; 密度过高, 造成营养不良, 再生细胞团很小, 而且很快停止生长。在一定范围内, 原生质体具有较强的恢复分裂能力, 一般密度以104-105mL-1为宜。

　　对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2- 4细胞），使用吸管或注射器。

　　继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。

　　含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。

　　在原生质体融合后的群体中，有融合体、未融合体、多元融合体和嵌合体,杂种细胞的筛选就是从中区分出预期融合重组类型。目前主要的筛选方法有3 种:

　　5、原球茎型：指兰属特有的器官发生方式，即外植体经培养产生原球茎，再直接长成植株。

　　1、母株制备：母株是指用于发生离体培养无性系的植物材料。制备无菌母株是整个离体无性繁殖过程中至关重要的一步。其技术关键是：a、材料灭菌；b、培养基筛选

　　2、增殖：即繁殖体的增殖阶段，使无菌母株在无菌条件下通过各种离体繁殖途径扩增，这是快速繁殖过程中最重要的阶段。在此过程中，外源激素的积累是需要注意的问题。

　　愈伤组织分化时外植体细胞的大小发生十分明显的变化，生长的愈伤组织的细胞平均大小不再减小，至此以后，保持相对不变。

　　如薄壁细胞、分生细胞、管胞、石细胞、纤维细胞、色素细胞、毛状细胞以及细胞丝状体等。

　　生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的，老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。

　　诱导形成的愈伤组织如果在原培养基上继续培养，细胞将不可避免的发生分化，产生新的结构，但是把它及时转移到新鲜的培养基上，则愈伤组织内的细胞可无限地进行分裂，维持其不分化的状态。

　　一般在愈伤组织长到直径2～3 cm时才将其与外植体分离，单独培养，并将其切成小块继续培养，此即继代培养。

　　生长迅速的愈伤组织多呈浅色、质地松散。若要进行愈伤组织的分化和再生，则应选生长较慢的愈伤组织。

　　没有污染的就是得到的无菌材料。如果它们能生长，增殖，并通过继代培养，就建立了无菌培养系。

　　细胞学观察一般每隔3～5天观察一次，可用肉眼观察其形态变化，也可用显微镜进行观察，如平板培养可进行定点观察，液体培养可用倒置显微镜观察，观察到的结果及时记录。

　　2漂浮法：其原理是根据原生质体和细胞或细胞碎片的比重不同，分离出原生质体。原生质体的比重小，在较高浓度的溶液中离心后会漂浮在液面上。在无菌条件下，把5-6ml浓度较高的溶液（如20%的蔗糖溶液）加入10ml的离心管中，在其上轻轻滴入1-2ml酶-原生质体混合液，封口后在150g下离心5min，原生质体漂浮于离心管上部的液面上。吸取上层，用液体培养基或含有CaCl2H2O的甘露醇溶液洗涤2-3次，悬浮1-2ml液体培养基中备用。

　　生根培养：1低盐效应2（部分种类）生根“激素杠杆”倒置3内外源激素的平衡（贯穿始终）。

　　移栽：1反常规“干处理”出瓶2暴露浓缩茎3要求基质透气性高4季节和温度的协同

　　多肉植物常温种质保存的要点如下：1低糖和高硬度培养基相结合。2缓冲体系和稳定剂的应用。3光照和温度的协同。4转瓶次数和方法的调整。

　　切下花蕾、消毒10分钟、冲洗两次、花药接种培养、愈伤组织或胚状体、再生培养、完整植株

　　（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板。

　　(4) 培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。

　　植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。

　　热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒，因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的效果。

　　感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约0.1-1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少、这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。

　　类病毒（viroid） ：没有衣壳包裹的共价闭合的单链环状RNA分子，大小为246-399个核苷酸，主要感染植物。

　　朊病毒疾病即海绵状脑病，是人和动物共患的一类遗传性、传染性和散发性的中央神经系统退行性脑病，最终可以导致患者死亡，它能在人和动物中进行传染 。

　　胚状体可以从以下几种培养物产生：直接从器官上发生；愈伤组织发生；从游离单细胞发生；从小孢子发生。

　　如茎尖、花芽、叶片、花托、鳞片等组织直接产生小苗，形成小苗（芽）之前也形成少量的愈伤组织。

　　1.基因型2.外植体的生理状态3.培养基的成分：无机盐浓度；植物生长调节物质；外植体脱分化条件；转移时间过长。

　　1.选择适宜的外植体2.最佳培养基3.连续转移 4.加抗氧化剂5.活性炭

　　⑥ 1958～1959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物任何部分都可以得到体细胞胚，如胡萝卜和毛茛上。

　　酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。

　　植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。

　　一是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使部分细胞处于离体的条件下。

　　阳桃又名杨桃、五敛子、三廉子，为酢酱草科阳桃属植物。阳桃的果实清甜多汁，酸甜适度，风味可口，果形独特美观，含有人体需要的多种维生素、氨基酸、矿物质及有机酸，具有较高营养价值和药用价值。但目前我国阳桃品种质量差，果实小且种子多，这严重制约阳桃的生产发展，急需加强优良品种的引种和选育工作，以培育无籽果实和提高果实品质。大多数被子植物胚乳为三倍体组织，三倍体植物具有无籽特性，人们试图通过胚乳培养获得三倍体植物，培育无籽品种。本试验旨在建立阳桃的胚乳愈伤组织诱导分化培养体系，为实现阳桃快速繁殖和选育优良品种提供依据。

　　它的特点是无机盐的浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，这使得它营养丰富，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，有加速愈伤组织和培养物生长的作用，当培养物久不转移时仍可维持其生存。

　　1沉降法：即过滤法，是利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。首先用孔径为30-40nm的微孔滤膜过滤酶混合液，后150g下低速离心3-5min，沉淀原生质体，遗弃上清液和酶液。用清洗液洗涤原生质体2-3次后，悬浮于1-2ml的液体培养基中备用。

　　光照强度：1000—3000lx，白色荧光灯，光的作用是满足形态建成的需要（诱导）。

　　进行培养的材料，应定期检查，特别是接种后的3～7天内，要每天检查，主要是检查其污染情况，发现污染材料，应及时处理掉。

　　③操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。

　　④必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。

　　② 多聚核糖体不断增加。截止M期前，每个细胞中的RNA含量增加到300％；

　　④ 酶活力也发生一定的变化。DNA复制前，DNA聚合酶活力增加；分裂前，与代谢有关的酶类，如己糖激酶和一些脱氢酶的活力也增加。

　　分裂期指细胞通过一分为二的方式，不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一但经过诱导，细胞脱分化，其外层细胞开始细胞分裂。

　　（5）利于种质资源长期保存和远距离运输，应用组织培养保存种质资源具有节约土地，节省人力、物力，手续简便，易于长远距离运输，而且不致受病虫害的侵袭，并便于交流的优点；

　　(6）提供育种中间材料，通过组织培养可获得不同性质的愈伤组织，可为原生质分离、融合或遗传转化提供优质材料；

　　在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件，使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，bob.com让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。

　　当5—7d后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。

　　分裂期的细胞分裂局限在组织的外缘，主要是平周分裂；而在分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢，直至停止；进而转向愈伤组织内部深处的局部地区的细胞开始分裂，使分裂面的方向改变了，出现了瘤状结构的外表和内部分化。

　　迅速生长的愈伤组织，都是极相似的，而当愈伤组织生长速度减慢时，就会出现特殊的形状和结构。在生长中的愈伤组织，一个共同的特征是：形成由分生组织组成的瘤状结构，变成不再进一步分化的生长中心，并在其周缘产生扩展的薄壁细胞。瘤状结构则成团分散分布在愈伤组织块中。形成了维管组织，但不形成维管系统，而呈分散的节状和短束状结构，它可由木质部组成，也可由木质部、韧皮部乃至形成层组成，细胞分裂素对促进组织维管化有重要作用。

　　从单个细胞或外植体上形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：（一） 诱导期（二）分裂期（三）分化期

　　概念：是指对分离出的原生质体进行培养、使其分裂分化直至形成完整植株的技术。

　　培养的方法：主要有平板培养法、液体浅层培养法、固-液结合培养法、看护培养法和微滴培养法等。各方法的操作及其优缺点。

　　起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。双子叶植物培养中, 大多以叶片为分离原生质体的材料, 近年来, 起始材料的适用范围扩展到以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体; 禾本科植物原生质体培养获得成功的试验, 几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。

　　愈伤组织源出于自然生长的植物受损伤时，在愈合伤口处长出的一团瘤状突起，瘤状突起内的细胞相对于植物体成熟细胞已发生脱分化的变化。

　　这一概念后来被引入植物组织培养领域。培养中的愈伤组织是指从外植体的内部或切口表面形成的一团没有分化的组织，这种组织具有再分化的能力。

　　常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。

　　有机氮作为培养基中的惟一氮源时，离体组织生长不良，只有在含有无机氮的情况下，氨基酸类物质才有较好的效果。

　　3、植株再生及鉴定：是指将继代增殖的小芽转移至生根培养基中，诱导根分化，最终形成具根、茎、叶的完整小植株的过程。

　　4、炼苗和移植：对再生植株的驯化、移植要认真对待。炼苗驯化过程要逐步过渡，使小苗从无菌状态转为自然状态，并逐步适应自然界的条件和多变状态。

　　试管苗移栽与驯化：试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。

　　1．激素浓度：激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。

　　2．琼脂浓度：培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少。

　　不同外植体来源的愈伤组织有一定的均一性。如叶栅栏组织细胞和根细胞在大小和形态上有一定的差异，但是两者诱导形成的愈伤组织就失去了原有的差异，变得比较均一。

　　若诱导条件不同，愈伤组织的形态和物理性质也有一定的变化，有的紧密坚实，有的疏松脆弱。例如，在柑橘子叶培养中，在MS附加1mg/l NAA与0.2mg/l 6-BA的培养基上形成的愈伤组织紧密坚实呈瘤状，而在MS附加0.2mg/l 2,4-D与0.2mg/l 6-BA培养基上形成的愈伤组织则疏松易脆。

　　1949年，LaRue首次提出用玉米未成熟胚乳建立起能够不断生长的愈伤组织，但未分化出器官。

　　1965年，Johri和 Bhojwani在柏形外果中发现，由培养的成熟胚乳可直接分化出三倍体茎芽。

　　1973年，印度学者 Srivastava首次由自养被子植物罗氏核实木的成熟胚乳中获得了三倍体胚乳再生植株。

　　试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18—200C，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。

　　要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系呼吸。

　　目前世界各国受病毒危害的植物极多，其中受害最严重的有粮食作物（如水稻、马铃薯、甘薯等）、经济作物（如柑橘、苹果、西红柿等）、花卉等。迄今已知的植物病毒种类就有500多种。但是，目前还没有一种可供治疗病毒的药剂。因此，病毒可以说是蔓延快、控制难、危害大的农业生产大敌。50年代应用茎尖分生组织（0.5cm）培养方法，获得无病毒植株。

　　由于病毒对植物造成如此严重的危害。所以世界各国都开始重视这方面的研究，如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系。美国用组织培养法，使苹果无病毒苗已工厂化育苗，并在各国普遍开展。

　　用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。

　　茎尖培养脱毒的优点：由于其脱毒效果好，bob.com后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。

　　在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需用带有适当光源的简单解剖镜(8—40倍)。

　　植物细胞工程指应用植物细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。

　　（1） 撕下表皮的目的是为了使酶溶液能很好地渗入其中。也可采用线min。还可用金刚砂（246目）摩擦叶的下表面。

　　（3）甘露醇：作为一中渗透压稳定剂，原生质体的一个基本特性就是渗透破碎性，因此必须加入渗透压稳定剂。目前用的比较多的有：山梨醇和甘露醇，适宜的浓度范围是：450-800mmol/L.

　　进行胚或胚乳培养，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%～10%的次氯酸钠溶液浸泡8～10min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。

　　用于培养的花药，实际上多未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒就可以了。一般用70%酒精浸泡数秒，然后用无菌水冲洗2～3次，再在漂白粉清液中浸泡10分钟，经无菌水冲洗2～3次即可接种。

　　在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定是最常用的方法，Ｘ病毒、Ｓ病毒和纺锤块状病毒很容易通过汁液来接种。

　　马铃薯常用的鉴定寄主植物有苋科的千日红，茄科的洋酸浆、毛曼佗罗等。寄主植物应在无虫网室中培养。

　　叶片洗净后。在消毒的研钵中研成糊状，用纱布滤出汁液，再用蒸馏水稀释１０倍作为接种物，在鉴定寄主植物的叶面，６００目的金刚砂混入接种物中，然后用左手心紧靠在寄主的背面，以右手实指蘸取接种液，均匀的在叶背面擦过，以不造成叶片产生伤痕为度，最后把叶面上多余的接种物用清水冲洗干净，放置在１5-２４的防虫室中，一般５-10天可发病。

　　步骤：1.诱导产生愈伤组织2.愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；

　　一、定义：用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。

　　二、优势：（与有性杂交方法比较）打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。

　　1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体, 开辟了原生质体融合研究的新阶段。

　　细胞密实体积（PCV）：将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，2000转下离心，用每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。

　　多肉植物的形态生理特点：1具有发达的薄壁组织2表面具有蜡质、毛或刺，表皮气孔少3多数采用景天科途径进行光合作用4细胞生理活性高5器官或组织的可组培性较高6常规繁殖方法的繁殖率低

　　植物离体繁殖的意义：1、繁殖速度快，经济效益高；2、占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗；3、繁殖各种珍稀、濒危苗木和突变体，为育种服务；4、在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。

　　该方法主要适用于：（1）加速某些难繁或繁殖速度低的植物，特别是一些珍稀名贵的花卉，需要发展的濒危植物的繁殖（2）用有性繁殖的方法难以保持品种特性的异花授粉植物，如油棕、猕猴桃、非洲菊等（3）需要去除病毒的植物（4）原种很少，生产上又急需推广的植物。

　　在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体组合化所用的时间，而且还可以节省土地面积。假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同。通过花药培养，在理论上只要有2n个Fl代花粉植株，就有可得到一个所需要的基因组合，而利用传统有种方法，则至少要有4n个F2植株才能得到这样一个组合。

　　常用的生长素:2,4—二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸 （NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA）等。

　　促进细胞分裂与分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成，促进侧芽生长及显著改变其他激素作用的特点。

　　常见的细胞分裂素有：2—异戊烯腺嘌呤（2-iP）、玉米素（ZT）、6—苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、苯基噻二唑基脲（TDZ） 。

　　1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和线．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。

　　(2) 草炭土：草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽种试管苗，宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。

　　(3) 腐殖土：腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋人坑中，灌水压实令其腐烂。第二年春季将其取出置于空气中，在经常喷水保湿的条件下使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。

　　1、理论和实践意义：是进行根系生理代谢研究的最优实验体系。研究器官分化、形态建成的良好体系。建立快速生长的根无性系。对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体。

　　2、培养方法：一般方法： 无菌种子萌发----根离体培养（多采用液体培养）----侧根----扩大繁殖。

　　3、培养基：低盐培养基：WHITE，其它培养基2/3MS，1/2MS，B5

　　Dmitry Ivanovsky: 1892年：Ivanovsky在研究烟草花叶病时发现，bob.com病叶的提取液经过细菌滤器过滤后，仍然具有使健康植株染病的能力－他找到了病毒。但他没能认识到这是一种全新的生命形式

　　胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。

　　胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。

　　控制器官发生的类型也受绝对用量的影响，不同的生长素和细胞分裂素，对生根和长芽的效果不同。

　　NAA生根比IBA和IAA效果好，但用IAA和IBA生根比较健壮,而NAA生根较细。

　　糖提供给外植体能量，而且还能维持一定的渗透压。培养基中的渗透压，对细胞增殖和体细胞胚的形成都有十分明显的影响，尤其在花药培养中受到重视。不同种类和浓度的糖，对组织培养的增殖及以后的器官分化均有明显影响。常用的有果糖、葡萄糖、蔗糖等，用量通常为 20～70g／L。

　　移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2—3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1—2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。

　　从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达90%以上。

　　离体叶片本身的位置对分化也影响很大。同一株烟草不同叶位叶片对器官分化的影响不同，发育完全的叶片，叶组织器官分化能力较发育幼龄叶片组织再分化能力低得多。

　　（5）叶脉：在离体叶片再生中，叶脉的作用也是明显的。不少植物的叶外值体，常从叶柄和叶脉的切口处（如杨树、中华猕猴桃等）形成愈伤组织和分化成苗。

　　（6）极性：极性也是影响某些植物叶组织培养的一个重要因素。烟草一些品种离体叶片若将背叶面朝上放置时，就不生长、死亡或只形成愈伤组织而没有器官的分化。

　　植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织中相似的培养基即可；较低时，则成份非常复杂，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等化学不明确物质；

　　临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。

　　然后用无菌水冲洗4～5 遍,置于无菌滤纸上吸干水分,用镊子剥出花药,去净花丝。

　　卫生部：从1985年发现首例艾滋病人到1999年9月底，共报告艾滋病病毒感染者15088例，其中艾滋病病人 477例，死 亡240例

　　Senda 于1979 年建立的电融合法，是目前最流行的物理诱导融合法. 迄今为止,通过电融合反复实验，已经测出了数十种植物原生质体的电融合数,如水稻、小麦、燕麦、马铃薯、油菜、胡萝卜、菜豆、蚕豆、烟草、矮牵牛等,并成功获得部分细胞杂种。

　　(1) 温汤浸渍处理：适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。

　　(2) 热空气处理：热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室(箱)内，一般在35—40℃。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。

　　③培养基成分：浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

　　④培养条件不当：如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

　　实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。

　　当将培养基中的无机盐浓度加倍，并逐步提高GA3浓度，即在2MTGA3(2-15mg/L)的培养基上后，球形胚状体才能通过以后各个发育阶段，最终形成完整的胚乳再生植株。

　　胚乳愈伤组织发生的部位：不同部位的胚乳细胞染色体组成情况可能有所不同，如苹果胚乳发育初期的各种异常有丝分裂及无丝分裂现象，在合点端比珠孔端更为普遍。

　　植物组织培养的接种是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程，是一种无菌技术。bob.com

　　整个操作的过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌。

　　采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。

　　试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。用原原种在一定隔离条件下产生原种1代，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代。

　　胚乳：位于种皮和胚之间，是种子内贮藏营养物质的部分，在种子萌发时供胚生长

　　胚的发生一般经过以下几个发育时期：合子(短暂休眠或无休眠)、原胚、幼胚、成熟胚

　　观点：(Haberlandt：) 高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞→小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞→首次进行离体细胞培养

　　我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。

　　1986年英国首次爆发疯牛病，已有17.7万头牛染病，上百万头牛被屠杀，损失400多亿美元。已有112人死亡，潜在感染人数超过50万。

　　病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产l0%-18%，为害马铃薯的病虫害则更多，大约有几卜种，田此，给马铃薯生产带来严重障碍。花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。

　　1964年，Guha和Maheshwari报道，在南洋金花中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。

　　1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到180余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就。

　　无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保存。

　　无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。一旦感染，便会影响产量和质量的保证。因此，应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。

　　植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术，做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子，因此，每次接种前半小时应进行地面的清洁卫生工作，并用70％酒精喷雾使空气的灰尘沉降。用紫外线分钟。接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗。

　　（1）在愈伤组织上同时长出芽和根，以后连成统一的轴状结构（较少），育成植株；

　　但在培养中一般先形成根的，往往抑制芽的形成；而相反，一般先产生芽的，则以后较易产生根。

　　组织培养中再生植株可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，再发育成完整植株。

　　它不但作为离体组织赖以生长的碳源，且还能使培养基维持一定的渗透压（一般培养基渗透压维持在1.5～4.1MPa）。

　　渗透压对细胞的增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响。一般多用蔗糖调节渗透压，其浓度为1％～5％，也可用砂糖、葡萄糖或果糖等。

　　在固体培养时，琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物。琼脂以色白、透明、洁净的为佳。琼脂是一种高分子的碳水化合物，从红藻等海藻中提取，仅溶解于热水，成为溶胶，冷后（40℃以下）即凝固为固体状的凝胶。

　　1971年，Takebe等在烟草上首次。由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。

　　1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种，后来在有性亲合及有性不亲会的亲本之间，不同作者又获得了若干其他的体细胞杂种。

　　化学融合原理：带有阴离子的PEG分子等与原生质体表面的阴离子之间在钙离子连接下形成共同的静电键，从而促进了原生质体间的黏着和结合。在高钙离子---高pH液的处理下钙离子和与质膜结合的PEG分子被洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使原生质体的某些阳电荷与另一些原生质体的阴电荷连接起来，吸附聚合，最后融合在一起。

　　质粒DNA和固氮菌DNA用同一限制性内切酶，出现粘性末端和固氮基因，使用DNA连接酶，形成重组DNA。导入水稻细胞，检测出含固氮基因的水稻细胞，检测成功表达固氮基因的水稻

　　含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生 长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。

　　（1）培养基体积固定（2）必须适当搅拌（3）培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长（4）但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移

　　只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

　　离体培养的外植体最好在植物生长的最适时期取材，即在其生长开始的季节里取样，若在生长末期或已经进入休眠期取样，则外植体会对诱导反应迟钝或无反应。

　　如苹果芽在春季取材成活率为 60％，夏季取材下降到 10％，冬季取材在 10％以下。百合鳞片外植体，春、秋季取材易形成小鳞茎，夏、冬季取材培养，则难形成小鳞茎。

　　3花粉发育期：四分体期、小孢子早期、中期和晚期（单核靠边期）、有丝分裂期和双核花粉期

　　4培养前低温预处理：3-5°C3-10天，提高小孢子反应能力：曼陀罗、天仙子、柑桔

　　a花药培养采用最多的培养基为MS。我国科学工作者研制的N6和马铃薯培养基；

　　起始于20世纪40年代，最初研究目的是调节和控制从花粉母细胞到成熟花粉的生长发育。大约经过半个世纪的发展，通过花药和花粉培养诱导形成单倍体植物，目前在世界范围内已得到普及，已从170多种植物成功地诱导形成花粉起源植株或愈伤组织，以茄科、十字花科蔬菜作物研究居多。在曼陀罗、番茄、麝香百合、银杏、烟草、矮牵牛等植物上都较早诱导成功单倍体植物。

　　高等植物的体细胞在一定条件下所诱导形成的胚，称为体细胞胚，即所谓的胚状体。

　　植物的体细胞具有形成胚的潜力。在植物组织培养中，培养细胞经诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。

　　细胞经分化后，发生持续细胞分裂增殖，并顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚和子叶期，进而成为成熟的有机体。

　　不同植物保持分化潜力的时间不同，且差异大。胡萝卜原来培养过程中丧失分化能力的一些组织，加入腺嘌呤、酪蛋白或酵母汁等物质后，器官分化能力可恢复到一定水平。

　　愈伤组织长期继代培养会引起其细胞内的染色体发生变化，如出现多倍体、非整倍体、染色体丢失、染色体断裂或重组，致使材料变为混倍组织，而且随着继代培养次数和时间的增加，变化频率也随之增加。愈伤组织继代培养物染色体的不稳定性，对保持供体植物的遗传稳定性是不利的。但对育种来讲，往往可以利用这种变化，从中筛选出具有有利经济性状（如高产、优质、抗病）的细胞系，供育成新品种之用。

　　第一、具有两极性，即在发育的早期阶段，bob.com从其方向相反的两端分化芽端与根端，而不定芽或不定根都为单向极性;

　　第二、胚状体的维管组织与外植体的维管织组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系；

　　第三、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y’形，而不定芽的维管组织无此现象。

　　物理法融合原理：对融合槽的两个电极施加高频交流电压，产生电泳效应，使融合槽内的原生质体偶极化并沿着电场的方向排列成串珠状，再施加瞬间的高压直流脉冲，使黏合相邻的原生质体膜局部发生可逆性瞬间穿孔，然后，原生质体膜连接、闭合、最后融合在一起。

　　这些实验结果导致了激动素和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作开展。

　　50年代开始以后的10年中，引人注目的植物组织培养的研究进展有以下6项：

　　①1952年，Morel和 Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。

　　（1）培养器皿：三角瓶、培养瓶、圆形培养瓶、果酱瓶、试管、L形管和T形管

　　植物体的各个部位，如根、茎（鳞茎、茎段）、叶（子叶、叶片）、花瓣、花药、胚珠、幼胚、块茎、茎尖、维管组织、髓部等。

　　在切取外植体之前一般须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。

　　将接处好的茎尖置于22℃左右的温度下。每天以16h、2000-30001x的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月培养才能成功。

　　由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光学显微镜也只能看到小至200bm的微粒，所以只有通过电子显微镜才能分辨0.5μm大小的病毒颗粒。这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。

　　经常使用的培养基，可先将各种药品配成浓缩一定倍数的母液，放入冰箱内保存，用时再按比例稀释。

　　母液要根据药剂的化学性质分别配制。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。

　　利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法，就是枯斑和空斑的测定法。这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。

　　指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes于 1929年发现的。他用感染TMV的昔通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦

　　初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。

　　3、通过离体叶组织、细胞的培养、探索离体叶组织、细胞培养的条件和影响因素，为叶片原生质体培养和原生质体融合研究提供理论依据。

　　4、利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系数。

　　一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38℃）2周。然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗干净，无菌条件下先用70％的酒精浸润组织15-20秒，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡4--5min，然后用无菌水冲洗3次。

　　把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留1-2个叶原基，0.2-0.3毫米，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgNAA、0.2mgGA3、0.5BA，2%蔗糖，pH值5.8。

　　（7）损伤：对离体叶片进行的损伤操作对于愈伤组织的形成具有一定的影响。大量的叶片组织培养证明，大多数植物愈伤组织首先在切口处形成，或切口处直接产生芽苗的分化。

　　损伤作为一种刺激，一方面是造成伤口处部分细胞的破损，细胞内某些物质流出产生的影响；另一方面，损伤造成了组织系统的分割，使整个外植体更趋于呈开放系统状态。伤口附近的未破损细胞，也不可避免的受到一定的应力形变和细胞内生化代谢的改变。而这种变化，对细胞分化具有很大影响。

　　为了提高其成活率，在培养基质中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂200-500倍液，以进行灭菌处理。通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。

　　适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1:1。

　　选材关键在于选取花粉处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雌发育。

　　步骤：选幼年树花蕾、取下花蕾、取花药镜检、3-5度低温冷处理3-10天、消毒接种培养、再生

　　植物的茎、叶部分多暴露于空气中，有的具有茸毛、油脂、蜡质和刺等，在栽培上又受到泥、肥中的杂菌污染，所以消毒前要经自来水较长时间的冲洗。

　　消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%～10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80，消毒后用无菌水冲洗3次后方可接种。

　　从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。

　　为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理另外，对栽培驯化基质要进行灭菌，因为试管苗在无菌的环境中生长，对外界细菌、线年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。后来，Laibach（1925，1929）把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子胚剥出，在培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；

　　1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功，这是有关根培养的最早的实验。

　　特点：含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用，但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长

　　在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛采用的基本培养基（如MS或B5）开始。当通过一系列的实验，对这种基本培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基。在改动一种培养基的时候，无机成分和有机成分应当分别处理。

　　利用植物病毒外壳蛋白的抗原特性，制备特异性的抗血清。利用抗原抗体特异性结合可以鉴定病毒。

　　3、器官发生型：特点：a、繁殖速度快b、遗传性不稳定，易产生变异c、愈伤组织是遗传转化、细胞培养或原生质体培养的良好材料。

　　叶组织培养常用的有MS、White、N6等培养基。培养基中的糖源一般都使用蔗糖，浓度为3％左右。培养基中附加椰子汁等有机添加物，有利于叶片组织培养中的形态发生。

　　对大多数双子叶植物的叶组织培养来讲细胞分裂素，特别是KT和6-BA有利于芽的形成；而生长素，特别是NAA则抑制芽的形成而有利于根的发生。2，4-D是一种强生长剂，有利于愈伤组织的形成。

　　将淡绿色致密的愈伤组织剔除褐色部分接入分化培养基中，分化培养基是MS加上NAA 0．1、0．2和ZT 1．0、2．0、3．0、4．0、5．0，筛选出适宜的诱导分化和再生植株培养基。取再生植株幼叶和根尖，采用去壁低渗法进行细胞学鉴定，随机抽取20株，每株观察10个细胞。

　　器官培养具有重要的理论意义：利用器官培养可以研究器官的功能及器官间的相关性、器官的分化以及更好的认识植物生命活动的规律、控制植物的生长发育，为人类实践服务。

　　水稻东格鲁病（Rice tungro）在东南亚一些国家是最具有毁灭性的病毒病，上世纪中期仅菲律宾每年因此病所致的稻谷损失即达140万吨；

　　水稻矮缩病（Rice dwarf）于19世纪末在日本一些地区流行，曾因此饿死1万多人；

　　在我国北方麦区间歇性暴发的小麦黄矮病（Barley yellow dwarf）平均造成30%的产量损失。在油菜上，因病毒病造成的产量损失常年达20~30%。

　　培养基：培养基成分非常重要。不同植物和品种差异大。常用的有MS、B5等。

　　在通过花药培养获得的再生植株中，除单倍体植株外，非单倍体出现的频率与植物种类、再生途径以及培养基的成分有关。一般来说，在通过胚状体途径获得的再生植株中，其单倍体植株占有率较高。但种类不同也存在差异。例如从烟草花药再生植株几乎全部是单倍体植株，而在大白菜和油菜上，单倍体植株则分别占74%和22%。在经过愈伤组织、器官分化途径所获得的再生植株中，倍性变化更为常见。如在水稻的花药培养中，再生植株的倍性变化为x~5x。

　　不足：1.缺乏常规育种各个分离世代的基因重组和交换，减少了优良基因积累的机会2.缺乏各种材料在田间观察评定的机会3.诱导单倍体的技术不完善，花药培养时出愈率、绿苗率不高，好的类型可能丢失。

　　单倍体育种程序：材料采集 ? 接种培养 ? 诱导愈伤组织?获得再生植株 ? 染色体加倍 ? 幼苗培育和品种选择

　　茎尖微繁殖过程一般包括五个阶段：① 无菌培养的建立② 芽的增殖③ 中间繁殖体的增殖④ 诱导生根⑤ 试管苗的移栽。

　　观赏植物中有不少遗传学上的嵌合体。如一些带镶嵌色彩的叶子、花、带金边、银边的植物等，在通过不定芽繁殖时，再生植株就失去了这些富有观赏价值的特性。

　　一般认为，矿质元素浓度高时有利于发展茎叶，较低时有利于生根，所以生根培养时一般选用无机盐浓度较低的培养基作为基本培养基。用无机盐浓度较高的培养基时，应稀释一定的倍数。如MS培养基，在生根、壮苗时，多采用1／2MS或1／4MS。

　　在培养基中最常改动的因子是生长调节物质，尤其是生长素和细胞分裂素。开始时，可以选择一种基本培养基，以及不同浓度的激素，比如说，各有5种不同浓度（0，0.5，2.5，5，10μmol／L）的某种生长素（例如 NAA）和某种细胞分裂素（例如6-BA）。这两种激素5种浓度的所有可能组合，即构成了一个具有25项处理的实验。由这25项处理中选出最好的一个，然后在保持浓度不变的情况下，再试验其他种类的生长素和细胞分裂素。当改变细胞分裂素的种类时，保持生长素不变，反之亦然。

　　研究表明，烟草成株期，叶组织脱分化和再分化需要的时间较长。而且叶片膨大体积较大，多在刀口处形成大量的愈伤组织和分生细胞团，芽苗大多发生在这些细胞分生团和结构致密的愈伤组织上。幼叶可以直接从不同部位成苗。

　　40年代和50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。Skoog（1944）和崔徵等（1951）发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例控制芽和根形成的主要条件之一。

　　常用的碳源、渗透剂以葡萄糖较好, 可获得较高的植板率, 且对细胞毒害也小 , 但有些植物用葡萄糖、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖等效果较好。

　　原生质体培养中的激素以生长素和细胞分裂素为主。不同植物的原生质体培养, 对激素的浓度要求差异很大, 需要生长素和细胞分裂素的适当搭配。但也有学者证明添加NAA可提高原生质体的分裂率。在禾本科植物原生质体培养中, 培养基中2,4-D 的作用十分重要。

　　用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。

　　抗原（antigens）：一切能在动物体内诱导产生抗体的物质，都叫抗原。蛋白、蛋白降解物、多糖等。

　　玻璃化苗外形与正常苗有显著差异。其叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。

　　产生玻璃化苗的因素：激素浓度；琼脂用量；温度；离子水平；光照时间；通风条件等。

　　2、特点：1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

　　愈伤组织（质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养）→液体培养基（防细胞破裂）→摇床振荡（转速30-150rpm）→悬浮培养

　　在某些雌雄异株植物（如石刁柏）中，若把花药培养技术包括到制种程序中去，在后代就有可能得到均匀一致的单性群体，这在有些情况下，可以显著提高经济效益。

　　在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合，有能克服受精前障碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。

　　对于病毒病，可通过茎尖培养消除病毒。这对解决马铃薯种薯退化问题能发挥重要的作用，在其他植物中也可用以建立无毒原种。

　　聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是二十世纪八十年代发展起来的一种DNA特定片段体外扩增技术，已被广泛地应用于植物病毒检测。

　　供体植株的遗传基因型：种类和品种影响大，开展单倍体育种是选择品种相当重要。

　　花粉的发育时期：多培养单核中期至单核晚期花粉容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。

　　2—3d后叶片止出现了局部坏死斑。在一定范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。

　　这种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至今，仍为一种经济而有效的鉴定方法。枯斑法不能测出病毒总的白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。

　　由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。

　　大量元素母液（10倍）—— ？微量元素母液（100倍）—— ？铁盐母液（100倍）—— ？有机物质母液（100倍）—— ？6-BA母液 ( 1mg/ml)—— ？NAA母液( 0.1mg/ml)—— ？蔗糖—— ？琼脂—— ？

　　由高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。当时采用的是机械方法，用利刃切割。

　　该方法的缺点是：一是产量低；二是由分生细胞和其他液胞化程度不高的细胞中分离原生质体时不适用。

　　1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中分离大量原生质体的可能性。

　　原生质体培养：指将植物细胞的细胞壁通过物理或化学的方法去除，然后再进行培养。原生质体培养的最大用处是体细胞杂交。

　　虽然组织培养技术的蓬勃发展只是近50年来的事。但它的整个历史可以追溯到上世纪初。从那时起到现在，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：

　　相差显微术法：观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、核存在表明有活力；

　　TTC法（2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑）：在活细胞中，TTC被还原成红色甲鐟，提取分光光度计检测。

　　伊凡蓝法：活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞

　　4．布质制品的灭菌：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品，放入高压灭菌器中，在压力为108kPa，温度为121℃的情况下，灭菌20～30min

　　5．无菌操作室的灭菌：无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2％的新洁尔灭或 70％的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70％的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。

　　植物种类不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理状态，对外界诱导反应的能力及分化再生能力是不同的。

　　选择适宜的外植体需要从植物基因型、外植体来源、外植体大小、取材季节及外植体的生理状态和发育年龄等方面加以考虑。

　　草本植物比木本植物易于通过组织培养获得成功，双子叶植物比单子叶植物易于组织培养。

　　愈伤组织是一种最常见的培养形式，因为除茎尖分生组织和一部分器官以外，其他的几种培养形式最终也都要经过愈伤组织才能再生植株。

　　器官培养是通过培养器官的类别来分类的。培养的是什么器官，就称为什么培养。如根、茎、叶、花、果实、种子的培养。

　　通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进行快速繁殖。

　　应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可以在一定程度上使高等植物的育种程序微化，从而大大提高选择效率。

　　在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体组合化所采的时间，而且还可以节省土地面积。

　　看护培图示：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织

　　（2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm2）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。

　　有些感染性因子比病毒更加简单，只有 一些小分子量的核酸或者只是一种蛋白 质。这些具有感染性的物质称为亚病毒 因子 Subvirus agents 。它们包括卫星、 类病毒和Prion。

　　卫星和卫星病毒都是由核酸分子（RNA 或DNA）组成的亚病毒因子。 卫星通常包埋在辅助病毒的衣壳内，而卫星病毒则单独有核衣壳，其衣壳蛋是由自身的 核酸编码的。它们的有效复制必须与辅助病毒共同感染寄主细胞才能完成。

　　2培养材料：植物培养、胚胎培养、器官培养、愈伤组织培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养

　　将外植体接种在培养基上，由于植物生长调节剂的存在，其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。

　　（1）加快了园艺植物新品种和良种繁育速度，特别是对于无性繁殖的果树、观赏树木等植物；

　　（2）培养无病毒苗木，这在香蕉、马铃薯、柑橘、草莓等植物上均得到了成功应用；

　　（3）获得倍性不同的植株，这对于无性繁殖园艺植物的育种，具有较大的利用价值因为愈伤组织形成过程中易发生染色体的核内加倍；

　　球状病毒：蛋白质亚基镶嵌在粒体表面，构成多面体形，内心是病毒的核酸；球状病毒并非光滑的球体，而是多面体（多为二十面体），多个正三角形组合而成。

　　杆状或线状病毒：蛋白质亚基螺旋状排列，中间是一个由核酸构成的空心管子，核酸也呈螺旋状排列，嵌入到螺旋状排列的蛋白质亚基内端。如，TMV杆状粒体。

　　在进行溶液过滤时，可使用孔径为0.22μm或更小的细菌滤膜。将滤膜安在适当大小的支座上，以铝箔包裹起来，或装入一个大小合适的有螺丝盖的玻璃瓶内，进行高压灭菌。

　　固体培养基的特点：使用简便，一般用于组织、愈伤组织、短枝、茎尖等材料的培养。特别适合植物的快速繁殖。

　　（2）茎：分地上部分和地下部分，地上主茎在形成16片叶子后，由花芽封顶，并在花的下部发生两个侧枝，从而构成马铃薯的主要同化系统。地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎。

　　（3）叶：先出土的叶是初生叶，全缘，心脏形。以后发生的叶奇数羽状全裂单叶，在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶。

　　3、化学试剂脱毒法：许多化学药品(包括嘌呤嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有：8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。

　　如将100μg 2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。

　　研究表明, 酶解之前对材料进行预处理有利于原生质体的分离。在正常培养基中生长的草莓试管苗幼叶,直接酶解仅能产生少量原生质体,如果在分离前将试管苗转入降低了蔗糖浓度的培养基中预处理2-3周,或暗处理1周, 原生质体的产量将大为提高。在悬铃木叶片酶解前, 将其放在CPW-12M(含质量分数为0.12的甘露醇)中1.5-2h, 使细胞质壁分离, 缩短了酶解时间。在实验中, 材料是否需要预处理要根据不同的情况而定。

　　花粉培养的优点：1从少量花粉获得大量花粉植株2避免花药壁产生的体细胞愈伤组织干扰，直接观察小孢子发育过程；

　　花粉培养示意图：选幼年树花蕾、取下花蕾（镜检）、低温预处理、消毒、取花药、预培养数天（药壁向花粉提供营养物质；通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质）、分离花粉、过滤离心、接种、再生

　　综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。

　　1、培养基：选择适宜的培养基、激素及其他添加物，对植物离体无性繁殖取得成功十分重要。

　　2、培养条件：不同植物离体无性繁殖的最适温度不同，大多为25±2℃，一般不低于15℃，不高于35℃。如烟草芽形成18℃最佳。培养容器内的湿度几乎为100%，一般环境要求保持在70%—90%之间。

　　这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少3h烘烤来消灭其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。

　　(1) 河砂：河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为1—2mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为0.1—0.2mm。河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。

　　左手拿试管或三角瓶，用右手轻轻取下包纸，以纸上的灰尘飞扬，造成污染。将试管或三角瓶的口靠近酒精灯火焰，瓶口倾斜，这时将管口外部在灯焰上燎数秒钟，将灰尘杂物等固定在原处，然后用右手的小指和无名指配合手掌面慢慢取出棉塞或橡皮塞。动作要慢，以免气流冲入瓶中造成污染。将瓶口在灯焰上旋转灼烧，然后用镊子将外植体送入瓶中，材料在培养容器内的分布要均匀，以保证必要的营养面积和光照条件。

　　含义: 将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。

　　用途: 分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。

　　热处理又称温治疗法(theomtherapy)，原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。

　　平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为1×10 3 -100×10 3 个/ml 。

　　初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度

　　1.4%琼脂基本培养基等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。

　　并对分离的单细胞进行了 “看护培养”。实现Haberlandt培养单细胞可能性的这一设想。

　　③1955年，Miller等由鲱鱼DNA中分离出细胞分裂素，并把它定名为激动素（kinetin）。

　　具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素（cytokinin）。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织（如叶肉和干种子胚乳）细胞进行分裂。

　　是一种较常见的植株再生方式，通过该种途径发生的植物目前有15种，如苹果、梨、大麦、水稻、玉米、杜仲、石刁柏等

　　3不连续梯度法：在离心管中加入不同浓度的Ficoll溶液，构成不同的浓度梯度，在上部加入1-2ml酶-原生质体混合液，在150g下离心5min，不同比重的原生质体漂浮在不同的浓度剃度的界面上，用吸管收集原生质体，悬浮洗涤备用。

　　1968年纤维素酶和离析酶投入市场后，植物原生质体才变成了一个热门的研究领域。

　　处理叶片小块、加入离析酶、释放出单细胞、消化细胞壁、加入纤维素酶、植物原生质体

　　Power和Cocking（1968）证实，这两种酶也可一起使用：即所谓的“同时处理法”和“一不法”。

　　微室培养图示：凹穴载玻片、1滴含单细胞培养液、周围加石蜡油、旁边加石蜡油、盖盖玻片、置培养皿中26~28 ℃恒温培养

　　（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。

　　在1899年发表的论文中，他提出： 烟草花叶病的病原是一种新的，非细胞性的物质，它不能独立繁殖，只能依赖活的组织进行繁殖。

　　目前已研究和命名的植物病毒达1000多种，其中许多为重要的农作物病原，其所造成的损失仅次于线、叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体而应用于育种实践。

　　采用休眠期的顶芽，剥去一部分鳞片后，在5％次氯酸钠溶液中浸泡 20min，进行表面消毒。 切取柱状叶原基进行培养。培养基采用Konp’s无机盐（部分修改）或Kundson（1951）配方，添加Nitsch配方中的微量元素和2％蔗糖、8%琼脂。pH5.5。部分实验中添加维生素、水解酪蛋白等。温度为24℃，人工光照24h。

　　④增加容器通风，最好进行CO2施肥， 这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；

　　后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。

　　⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。

　　当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。

　　① 突变细胞互补选择法。包括遗传互补、营养缺陷互补、白化突变体之间互补以及生长激素的自主互补等。该方法的局限性在于突变体不易获得, 而且有些突变体不易再生, 所以尚未得到广泛应用。

　　② 根据原生质体特性差异的机械选择法。例如根据愈伤组织的颜色、荧光特性等在显微镜下机械分离杂种细胞。当以荧光特性作为根据时, 可采用流式细胞光度计来区分杂种细胞, 该法不但准确, 而且效率高(大约5×102 个细胞/s),用荧光化合物标记原生质体并不影响细胞再生植株的能力, 但由于仪器价格昂贵, 使用者还很少。

　　优点：1比栽培原料作物更易控制最佳生产条件2培养物为无菌、无虫材料，能保证产品质量3工艺操作较为简单，可减少劳动费用，提高生产率。

　　Gautheret（1934）在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加。 这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成获得首次成功。同年，white由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜也建立了类似的连续生长的组织培养物。 Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。

　　最为多样：基因组除双链DNA外，还有单链DNA，单链和双链RNA，还有反转录

　　有些病毒还有一层脂质双层包膜，病毒包膜来源于细胞膜，但又不是完全意义上的细胞膜。

　　特点：无机盐浓度较低。它的使用也很广泛，无论是生根培养还是胚胎培养或一般组织培养都有很好的效果。

　　特点： KNO3和（ NH4）2SO4含量高，不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。

　　假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同。通过花药培养，在理论上只要有2n个Fl代花粉植株，就有可得到一个所需要的基因组合，而利用传统有种方法，则至少要有4n个F2植株才能得到这样一个组合。

　　在某些雌雄异株植物（如石刁柏）中，若把花药培养技术包括到制种程序中去，在后代就有可能得到均匀一致的单性群体，这在有些情况下，可以显著提高经济效益。

　　驯化的目的：在于提高试管苗对外界环境条件的适应。