bob.com育种学）生物技术在园艺植物育种中的应用ppt

　　bob.com* 二 突变细胞的筛选方法 用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。 贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4％ NaCl的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系游离氨基酸含量是供体亲本的4.1倍。 正向选择: * * 间接选择: 间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。 Dorffling等以Pro类似物羟脯氨酸（HYP）为选择剂，获得了耐HYP的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传。 林定波等将锦橙珠心细胞愈伤组织的悬浮细胞经γ射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，并再生植株。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高1.4 ℃和2.4 ℃，突变系体内的Pro含量比供体增加了一倍。 * 三 突变性状遗传基础及其稳定性鉴定 体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的是基因水平上的变异。 从利用体细胞变异的角度，染色体变异大多是一些畸形变异，真正可利用的染色体变异十分有限。 基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的改变，不会影响再生植株的正常生长发育。因此，从再生植株的这些变异中有可能筛选有益的变异。 基因水平上的变异，从根本上讲是DNA的碱基突变或修饰状态的改变。 * 玉米幼胚所诱导的愈伤组织在继代繁殖后，用NaCl作选择剂，在含质量浓度10～20 g·L-1 NaCl的N6筛选培养基上连续筛选3代，再转移到无盐的继代培养基上培养3代，得到耐20mg·L-1的抗盐愈伤组织变异体。 耐盐株自交得T1代种子，在不同质量浓度NaCl胁迫下测定其发芽率，耐盐变异体后代种子发芽率均高于对照种子发芽率，说明变异体的耐盐性是可遗传的。 * 农业上有用性状的突变体离体筛选 对病害的抗性 对土壤障碍的抗耐性 对除草剂的抗性 对温度的抗耐性 * 第五节 基因工程与育种 植物基因工程（plant genetic engineering）：指以类似工程设计的方法，按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的DNA片断，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。 转基因植物：ransgenic plant 转基因技术: Transgenic technique * 一 、基因工程的基本步骤和方法 目的基因的分离与鉴定 植物表达载体的构建 植物的遗传转化 转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定 基因分离、克隆 农杆菌介导 基因枪介导 基因插入Ti/Ri质粒载体 农杆菌侵染植物 包裹DNA的微粒弹 质粒DNA制备 基因质粒进入植物细胞 DNA整合进植物染色体 基因枪轰击植物细胞 检测转基因 筛选转基因细胞 转基因细胞再生植株 检测转基因 农杆菌和基因枪介导基因转化流程图 * * 二 基因工程在园艺植物育种中的应用 改良品质 提高抗病虫能力 改良抗逆性 提高光合作用和固氮效率 创建雄性不育材料 延迟成熟与保鲜 选育抗除草剂品种 * 第六节 分子标记与育种Molecular marker & breeding * 形态标记（morphological markers） 细胞学标记（cytological markers） 生化标记（biochemical markers） 分子标记（molecular markers） 遗传标记的种类 遗传标记（genetic markers）：鉴别基因组中基因位点(site)的手段bob.com，是易于识别且可遗传的实体。 种类： * 形态标记 形态标记：指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、果形、花色、叶形、花瓣数多少、核有无或抗逆性、抗病性等。 特点：简单直观，长期以来，作物种质资源鉴定及育种材料的选择一般都是根据形态标记进行的，但是形态标记数目少，多态性差bob.com，易受环境因素的影响。 应用实例： 园艺植物品种识别 枳在柑桔原生质体融合中的应用 * 细胞学标记 细胞学标记：染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。染色体结构特征包括染色体的核型(染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等)和带型(Constitutive heterochrom -ative banding带、Necleolar organizer region banding带、Giemsa banding带等)。 特点：可明确鉴定许多物种中任一染色体。操作复杂，信息量小。 应用实例： 资源分类与品种鉴别 多倍体亲缘关系与系统进化 染色体组分析评价亲缘关系 原位杂交进行基因物理定位 * 生化标记同工酶 同工酶：指有同一底物专一性，催化同一化学反应，结构、组成不同的一类酶。 基本原理是根据电荷性质的差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和专门染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同的基因型。 特点：受环境因素影响小，呈共显性，在分离世代中能反映各单株的基因型，检测相对简单快速，在种子和幼苗期就可以鉴定，费用不高。 具有组织bob.com、发育和物种特异性。 应用实例： 品种质量和纯度鉴定 遗传多样性研究 * 分子标记 分子标记：以直接检测DNA碱基序列的差异为基础的遗传标记，又叫DNA分子标记。 特点：数量多，遍布整个基因组；标记本身无害，很少与不良性状连锁；标记不需要基因表达，可用个体的任何材料进行检测，不受环境条件的限制；多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。多以DNA片段电泳谱带形式表现。 应用： 种质资源研究 辅助育种 功能基因组研究 基因克隆 黄瓜雌性系分子标记辅助选择 * * RAPD标记鉴定 510 1100 670 bp 750 250 500 2000 1000 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 以大白菜高抗TuMV白心株系912112和高感TuMV桔红心株系T12219为亲本建立的小孢子培养DH系作为图谱构建群体, 构建了包含10 个连锁群、406 个标记位点的分子连锁图谱, 图谱总长度826.3 cM。 该连锁图谱包括246个AFLP标记、135个RAPD标记、11个SSR标记和12个同工酶标记、1个SCAR标记和1个形态标记。 大白菜遗传图谱的构建 * 以大白菜高抗TuMV白心株系912112和高感TuMV桔红心株系T12219为亲本建立的小孢子培养DH系作为图谱构建群体 * * 分子标记在园艺植物育种的应用 构建遗传图谱 分析亲缘关系 定位农艺性状 分子标记辅助选择 种质资源及杂种后代的鉴定 * 复习题 基本概念：生物技术、组织培养、外植体、体细胞杂交、体细胞无性系变异、基因工程、分子标记 简述各项生物技术方法在园艺植物育种中的主要应用。 * 第三节 原生质体培养 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或一个被质膜所包围的细胞。 * 原生质体分离与纯化 Isolation and purification 原生质体培养: Protoplast culture 原生质体融合：Protoplast fusion 体细胞杂交: Somatic hybridization * 原生质体分离 基础材料准备 预处理与酶解 原生质体活力测定 原生质体收集与纯化 无菌试管苗叶片 上胚轴和子叶 ?培养细胞等 * 材料预处理 在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力bob.com。不同植物及材料类型预处理方法不同。 例如龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。 * 酶解 酶: 纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶 溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 pH 缓冲剂: MES 渗透压调节剂: 葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 酶解温度 酶浓度 酶解时间 * 组成成分(mg/L) 用量 组织苗 下胚轴 纤维素酶(%)（Onozuka R-10） 1.3 1.1 离析酶(%) (Macerozym R-10) 0.3 0.25 聚乙烯吡咯烷酮(%) (PVP-6000) 2 2 2-N-吗啉乙烷磺酸（MES）(mmol/L) 3 3 酪蛋白水解物(CH) (%) 0.01 0.01 渗压调节剂(蔗糖) (mol/L) 0.26 0.26 羧苄青霉素(%) 0.02 0.02 pH值 5.6 5.6 酶溶剂采用简化的CPW盐溶液(含10mmol CaCl2·2H2O，0.7mmol KH2PO4)，pH用1N HCl或1N KOH调至5.6 马铃薯原生质体的游离酶解液组成 * 原生质体分离常用的商品酶 酶 来 源 生产厂家 纤维素酶类 Onozuka R–10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶 Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA * 收集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。 * 原生质体活力测定 目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。? FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，死细胞被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。 * 原生质体培养 液体浅层培养 固体平板培养 固—液体双层培养 琼脂糖珠培养 * * * 体细胞杂交 定义：将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A + B） 几种不同的表述： 体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion * * 体细胞杂交与有性杂交的异同 比较内容 体细胞杂交 有性杂交 时间 无季节限制 花期限制，特别是母本的花期 亲缘关系 一定程度上可以克服有性/嫁接不亲和性 受亲和性影响 结果 细胞核、细胞质均可以重组、倍性增加 双受精，一般无细胞质重组，倍性不改变 * 对称融合 * 不对称融合 不对称融合 * * * * 用于细胞成对融合的显微操作仪 * 原生质体融合 杂种细胞筛选 方法：PEG，电融合， NaNO3 营养互补选择法， 遗传互补选择法， 机械选择法， 形态学方法 细胞学方法 同工酶方法 分子标记法 体细胞杂种植株的鉴定 亲本A 亲本B 原生质体聚合 融合处理 分离的原生质体 原生质体融合 融合体移植 杂种融合体筛选 杂种融合体移栽 至不同的培养基 体细胞杂交筛选 * * 原生质体培养和体细胞杂交的应用 * * * 番茄与近缘野生物种体细胞融合的杂种 * 第四节 植物细胞突变体的离体筛选 一：基因组突变，如染色体数目的改变或细胞质基因组的增减； 二：染色体突变，指染色体较大范围的结构变化，涉及多个基因； 三：基因突变，指范围在一个基因以内分子结构的 改变。按DNA的改变方式有碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。 体细胞无性系变异：Somaclonal variation 一 突变体的产生 * * * * * 生物技术育种Breeding by bio-technique 田振东* 生物技术(Biotechnology)是以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。 生物技术是在分子生物学和细胞生物学基础上结合现代工程学的方法和原理而发展起来的一门综合性科学技术。 * * 第一节 组织与器官培养 第二节 花药与花粉培养 第三节 原生质体培养 第四节 植物细胞突变体的离体筛选 第五节 基因工程与育种 第六节 分子标记与育种 本章主要内容 * 相关专业术语 细胞全能性(Totipotency): 一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。 外植体(explant): 用于培养的离体植物材料。 愈伤组织(callus): 在培养过程中，从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。 胚状体(embryoid): 由外植体或愈伤组织产生的,与正常受精发育方式类似的胚胎结构。 * 植物组织培养 Plant Tissue Culture 将植物离体器官、组织或细胞等外植体，在适宜的人工培养基和无菌条件下，给予光照、温度等环境条件并培养，使其生长、增殖、发育形成小植株的方法。 广义上组织培养技术，包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养等。 第一节 组织与器官培养 * 植物特殊 倍性创造 植物 组织培养 培育植物 新品种 种苗脱毒与 快速繁殖 体细胞杂交 次生产物 生产 基础研究 * 组织与器官培养(tissue and organ culture): 茎尖和分生组织培养; 离体叶的培养。 * 组织和器官培养全过程可分四个阶段: 无菌培养物的建立 营养繁殖体的增殖 生根 植株移栽 各个阶段在培养基,生长调节剂的配比和浓度, 培养方式和环境上都不同的要求. 如：甘蓝子叶培养， 首先在MS培养基中附加BA 1～3mg/L，NAA0.25～1mg/L诱导愈伤组织分化。 其次，在培养基中添加细胞分裂素含量为2mg/L左右，诱导不定芽。 最后，NAA0.5～1mg/L的生根培养基可诱导成根，从而发育形成完整植株。 * 早期生长素高，愈伤形成后降低浓度 炼苗与移栽 * * * 体细胞胚形成需要经过至少两个阶段： 第一阶段，在含高生长素浓度的培养基中，诱导培养胚性细胞； 第二阶段，在较低生长素或无生长素的培养基中形成体细胞胚。 体细胞胚成苗 * * 组织和器官培养在育种中的作用 加快园艺植物新品种和良种繁殖速度 培养无病毒苗木 诱发和离体筛选突变体 进行种质资源长期保存和远距离运输 获得倍性不同的植株 克服种子发育和萌发中的障碍 克服远缘杂交困难 提供育种中间材料 * * 植物工厂化快速繁殖（荷兰） * 第二节花药与花粉培养 * 花药培养：其外植体为完整花药，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。 花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。 花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。 diploid 植物，其haploid即为monoploid 番茄 2n = 2x = 24 n = x = 12 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid植物，其haploid为dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 hexaploid植物，其haploid为triploid 普通小麦 2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid植物，其haploid为tetraploid 草 莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28 * * 花药培养的基本程序 外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养 外因方面：培养基的成分，外源激素的种类，糖的浓度 内因方面：主要决定于花药中花粉发育时期 * 培养基 花药培养常用的基本培养

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