bob.com植物培养资料doc

　　bob.com植物组织培养:指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体，培养在人工配制的培养基上bob.com，人为控制培养条件，使其生长、分化、增殖，发育成完整植株或生产次生代谢物质的过程和技术。也称为离体培养。 外植体:凡是用于离体培养的细胞、组织或器官统称为外植体。 组织培养六要素: 无菌条件 外植体 人工培养基 人工条件:温度、光强、光照时间 细胞全能性:增殖、分化、发育成完整植株 培养容器:能进行气体交换 培养材料类型: 1. 组织培养:指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、薄壁组织等）或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养，是狭义的组织培养。 2. 器官培养:植物的六大器官的无菌培养 3. 胚胎培养:幼胚、成熟胚bob.com、胚乳、胚珠、子房的无菌培养 4. 细胞培养:指对单个细胞或较小细胞团的离体无菌培养，获得单细胞无性繁殖系。 5. 原生质体培养:指以除去细胞壁的细胞（原生质体）为外植体的离体无菌培养。 6. 其他:次生代谢物生产、脱毒培养、人工种子等。 按照培养过程分为:初代培养和继代培养 按照培养基类型分为:液体培养和固体培养 按照培养目的分:愈伤组织培养、分化培养和生根培养 主要研究任务: 细胞、组织、器官等在离体培养下的: 营养条件、激素、培养条件 形态发生 脱毒方法与机理 再生植株的遗传稳定性 种质资源离体保存的机理与方法 细胞离体融合机理与方法 细胞全能性:指植物体的任何一个有完整细胞核的活细胞都具有该种植物的全套遗传信息和发育成完整植株的能力。 植物细胞的全能性是潜在的，要实现植物细胞的全能性，必须具备一定的条件: 1.细胞与植株分离，脱离植株的控制； 2.创造适合于细胞生长和分化的培养基和培养条件； 3.要有成功的再生体系，即获得再生植株。 植株再生的过程即为植物细胞全能性表达的过程，一般经过脱分化和再分化两个阶段。 细胞分化:指细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，逐渐失去分裂能力bob.com，而形成各类植物组织和器官。由种子萌发到长成完整植株，这是胚性细胞不断分裂和分化的结果。 细胞分化形成不同的器官和组织，即细胞分化导致形态发生 组织培养的形态发生有两种途径:一种是器官发生另一种是体细胞胚胎发生 脱分化的难易程度与植物的种类、组织和细胞的状态有关。 一般单子叶植物比双子叶植物难；成熟的植物细胞和组织比未成熟的植物细胞和组织难；单倍体细胞比二倍体细胞难。 再分化:指离体的植物细胞或组织经脱分化培养后再次进行分化，形成新的细胞、组织、器官的过程。 再分化有两种方式：一种是器官发生，一种是胚胎发生 形态建成 （愈伤组织到再生植株） 先芽后根，这是最普遍的发生方式； 先根后芽，但芽的分化难度比较大； 在愈伤组织块的不同部位上分化出根或芽，再通过维管组织的联系形成完整植株。 通过在愈伤组织表面或内部形成胚状体，是愈伤组织形态发生的特殊方式。 影响组培苗遗传稳定性的因素 1.基因型 2.继代次数与继代时间 3.形态发生:以茎尖、茎段发生不定芽，变异率低 以花器官诱导的植株，变异率高 胚状体发生途径，变异率低 愈伤组织悬浮培养分化不定芽，变异率较高 4.外源激素:激素影响细胞有丝分裂，高浓度激素作用下，细胞分裂和生长激素加快，不正常分裂频率增高，再生植株变异增多。 减少变异，提高遗传稳定性的措施 （1）选取具有分生点的茎尖或幼嫩的器官为外植体 （2）缩短继代时间，减少继代次数 （3）采用胚状体发生方式 （4）采用适当的激素种类和浓度 （5）减少或不使用容易引起诱变的化学物质 植物离体快速繁殖特点:繁殖系数大，周年生产，繁殖速度快，苗木整齐，可工厂化生产。 次生代谢物:植物组织培养能产生很多种药物，主要有苷类、生物碱、固醇类、醌类、黄酮类、蛋白质及其它生理活性物质。 植物组织培养: (1)是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。按照外植体的不同，组织培养可分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养。 (2)理论依据---细胞全能性 (3)培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而发展迅速。 (4)农业生产上的应用主要体现于以下几个方面:快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。 细胞分化:指细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，而形成各类植物组织和器官。 脱分化:也称去分化，一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织的现象叫脱分化。 脱分化的机理:脱分化诱导期间会导致细胞膜透性改变，细胞核增大，内质网范围扩大，多核糖体形成，过氧化物酶增加，蛋白质和酚类物质合成活跃等。 影响脱分化的主要因素: （1）损伤。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。 （2）在诱导愈伤组织时常加入生长素，但配合细胞分裂素的效果更好。 （3）弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。 （4）外植体的状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应bob.com。 （5）植物种类的差异。 一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。 诱导期:是细胞分裂的准备时期，是愈伤组织形成的起点。 特点：处在静止状态的成熟细胞通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使其细胞内合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸物质的合成，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大，细胞大小变化不大。 分裂期:指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞，即发生脱分化的过程。 特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。细胞体积迅速变小。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高时，标志细胞分裂进入了高峰期。 形成期：是指外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成无序结构的愈伤组织。 特征：细胞的平均大小相对稳定，不再减小。形成瘤状结构的外表和内部分化；出现多种类型的细胞。 MS培养基：无机盐和例子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。起养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地运用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养。 B5培养基：含有较低的铵，适于双子叶植物，特别是木本植物。 White培养基：无机盐数量较低，适于生根培养。 N6培养基：KNO3和(NH4)2SO4含量高。常用于禾谷类植物的花药培养。细胞及原生质体培养。 植物的离体器官发生:指从植物叶片、子房、花药、胚珠、叶柄等，诱导出愈伤组织，由愈伤组织上诱导不定芽，进一步发育，形成完整植株。 特点：这种方法从原来成熟组织上重新诱导出分生组织，发生单芽或丛生芽。 器官发生再生植株的方式： A 先形成芽，芽的基部后产生后根； B 先形成根，根上再出芽； C 愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成微管束组织把两者结合起来. 植物体细胞胚胎发生:植物离体培养的细胞诱导分化出类似胚的结构，进而长出完整植株的过程称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。 过程: 愈伤组织形成/胚性愈伤组织形成/胚状体形成/胚萌发和成苗 影响植物离体形态发生的因素: 一 植物种类和基因型 二 培养材料的生理状态 三 培养基 四 培养条件 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别：? ①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端；而不定芽和不定根都为单向极性。? ②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。 ③胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”字形，而不定芽的维管组织无此现象。 影响植物离体形态发生的因素有不同品种的基因型、外植体的选择状态、培养基和培养条件。 植物组织培养的完整过程一般分为： 培养基的选择和培养条件的确定 外植体选择与处理 接种、初代培养 继代培养 生根培养 试管苗的驯化移栽成活 培养基的成分包括 水 无机盐 有机物 植物激素 培养物的支持材料 无机盐：大量元素：主要有N、P、K、Ca、Mg、S等。 微量元素：主要有Fe、Mn、Cu、Mo、Zn、Co、B等。 缺素症： 氮：不能形成导管，表现花色素苷的颜色 钾和磷：细胞过度生长 硫：明显腿绿 铁：细胞分裂停止，失绿症状 硼：细胞分裂停滞，细胞伸长 锰和钼：影响细胞伸长 有机物： 糖：提供碳源、能量 维生素：VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用；在低浓度的细胞分裂素下，特别需要添加VB1、VB6才能促进根的生长；VB5与植物代谢和胚的发育有一定关系；VC有防止组织褐变的作用。 肌醇：促进愈伤组织的生长、胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化也有促进作用。对细胞壁的形成也有作用。 氨基酸：有机氮源 天然有机复合物 植物激素： 生长素：主要用于诱导愈伤组织形成，促进根的生长。协助细胞分裂素促进细胞分裂和伸长。 细胞分裂素：诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖。 赤霉素：刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。 外植体的选择: 1.植物基因型：双子叶植物易于单子叶植物 2.生理状态：幼嫩、年限越短的组织 3.取材季节：在其生长开始的季节选取 4.植物的长势：生长健壮的器官或组织 5.取材部位：取易出愈伤组织的部位 6.外植体大小：在0.5～1.0 cm为宜 无菌概念： 无菌的范畴是指经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，或经其他理化灭菌方法处理后的物体等都是无菌的。 灭菌与消毒的含义及其差异： 所谓灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有有生命的物质全部杀死； 而消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。 灭菌与消毒的主要区别在于前者杀菌强烈，能杀死所有活细胞；后者作用缓和，主要杀死或抑制附在植物材料表面的微生物，但芽胞、厚垣孢子一般不会死亡bob.com。但是，灭菌与消毒是相对的，如果消毒时间过长或消毒剂浓度过高，也可杀死全部活的细胞，消毒就成为灭菌了。反之，灭菌剂只能起到消毒作用。 灭菌方法：压力蒸汽灭菌、灼烧灭菌、过滤灭菌、紫外线灭菌 植物组织培养过程：离体的植物器官、组织、细胞（脱分化），愈伤组织（再分化），根芽，再生苗。 植物组织培养条件：温度、光照、湿度、渗透压、pH值、培养基、无菌条件。 提高试管苗驯化移栽成活率的措施： 1. 提高组培苗质量。 2. 及时出瓶驯化，避免组培苗老化。 3. 选择适当的移栽基质，要求疏松、保水和保肥，易灭菌，常用的基质有蛭石、珍珠岩、营养土等。 4. 移栽前根系处理，根部培养基清理掉，不能伤根和叶。 5. 移栽后的温度和湿度控制，注意温度和保湿。 6. 适当采取遮阴措施，可降低蒸腾失水，也可避免强日照对叶片的灼伤。 7. 加强肥水管理和病虫害防治。 (1)植物组织培养基本技术流程包括培养基的配制、外植体的选择与处理、接种和继代培养、试管苗的移栽以及培养环境条件控制等。 (2)培养基的成分有水、无机盐、有机化合物、激素、凝固剂等。 (3)一般多选择茎段、茎尖、叶片、花药等幼嫩的组织作为组培的外植体 (4) 灭菌的方法有压力蒸汽灭菌、过滤、灼烧和紫外灭菌。 (5)培养条件：温度 23-27 湿度 70-80% PH值5.5-6.0 (6)创设从试管苗生境逐渐向室外环境转化的过渡条件，以确保试管苗的移栽成活率。 外植体： 一般来自无菌种子发芽产生的幼根 植株根系经消毒处理后的切段 普通茎尖培养： 取材：挑选杂菌污染少，生长不久的茎尖。木本植物可在取材前对茎尖喷几次灭菌药剂。以保证材料不带或少带杂菌。用于普通茎尖培养，可先从植物的茎、藤或匍匐枝上切取2cm以上的顶梢。 灭菌：将采到的茎尖切成0.5-1.0cm，并将大叶除去，休眠芽预先剥除鳞片。将茎尖置于流水冲洗2～4小时(视干净程度），再在70%的酒精中处理10-30秒，然后30%的次氯酸钠中浸10-15分钟，最后用无菌水冲洗3-4次，或者用0.1-0.2%的氯化汞灭菌5-10分钟，无菌水冲洗5次以上。 接种：为了减少污染，可在接种前再剥掉一些叶片，使茎尖为0.5cm左右。有些植物的茎尖由于多酚氧化酶的氧化作用而发生褐化，使培养基变褐，影响材料的成活。所以在接种时，不能用生锈的解剖刀，动作要敏捷，随切随接，减少伤口在空气中暴露的时间。 培养：初代培养，继代培养，诱导生根，驯化移栽。 脱毒培养：取材，灭菌，接种，培养 叶的培养：取材与灭菌，接种，培养（光培养） 植物器官培养主要是指离体的根、茎、叶、花器和果实、种子的无菌培养，是植物组织培养中最主要的一个方面。 植物器官培养不仅是研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态建成的最好材料和方法，而且具有重要的应用价值。 植物细胞培养：指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细无性系或再生植株的技术。 单细胞分离：1.机械法：叶片研碎、过滤、离心 2.酶解法：酶降解胶层，获得游离的细胞团 单细胞培养方法： 平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。 看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上分离单细胞，滤纸置于活跃生长的愈伤组织上，分离的单细胞放在滤纸表面，进行培细胞养的方法。 微室培养法：悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。 条件培养基培养：条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养。 细胞悬浮培养的建立：愈伤组织的诱导，悬浮系的建立与继代培养，悬浮细胞的生长动态，影响悬浮细胞生长的因素，悬浮细胞同步化 饥饿法：饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。 抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。 原生质体：脱去细胞壁的细胞叫原生质体 (2) 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广； (3) 一次操作可实现两个以上亲本的融合作用 (4) 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； (5) 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种； 细胞分离的方法有机械法和酶解法 单细胞培养方法有平板、看护、微室、条件培养基等培养法 细胞悬浮培养过程：愈伤组织诱导，悬浮系的建立和培养，悬浮细胞的生长动态，悬浮培养细胞的同步化等 原生质体培养过程：原生质体分离及纯化，活力测定，细胞壁再生及细胞分裂，愈伤组织和胚状体形成，植株再生。 原生体质融合的影响因素：PEG Ca2+PH融合时间等 体细胞杂交意义：实现远缘杂交，获得种间杂种，克服配子自交不亲和性 花药培养和花粉培养：花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。 花药培养与花粉培养异同： 从概念上看，花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，形成植株，属器官培养。花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，属细胞培养。 从培养目的看，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。 从培养技术看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功。 意义：培育形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期； 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。 获得无病毒个体。 花粉和花药培养的意义在于诱导单倍体育种；有利于筛选隐性突变体和获得无病毒个体。 花药培养的步骤为取花蕾、低温预处理、消毒、分离花粉、接种、培养、再生。 马铃薯脱毒过程：试管基础苗，脱毒小薯，无性繁殖获得良种1代 和2代 脱毒苗的鉴定方法：①指示植物鉴定法；②抗血清鉴定法；③电子显微镜检查法；④酶联免疫鉴定法。 1

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