【国科科技港】最新专利：高粱醇溶蛋bob.com白、染色体工程化、增强ACCase的方法
bob.com很多技术和产品的创新由于各种原因无法或暂时无法发表研究论文（高影响因子论文和高价值专利评判标准的不同、保持新颖性的需要、保密技术细节的需要等），因此公开的专利信息就是跟踪最新技术和产品的重要渠道。
然而，中国的专利年申请量已接近500万件，如何从浩如烟海的专利资料中找寻到有价值的信息是一项具有挑战的工作。
本专栏将定期梳理最新公开的农业生物技术领域的发明专利，并就部分专利进行简单介绍，以为相关从业者提供有价值的信息参考。
南京农业大学申请的专利50（发明人：李艳;李阳;盖钧镒）公开了大豆ABC全转运蛋白GmABCC3编码基因的应用。大豆ABC全转运蛋白GmABCC3的编码基因在耐铝毒大豆品种中受铝诱导显著上调表达，耐铝毒大豆品种中含优异铝诱导型启动子GmABCCPro2。过表达该基因的优异单倍型GmABCC3CDS2，能够显著提高大豆和拟南芥的耐铝毒能力。在酵母菌株中过表达该基因的优异单倍型GmABCC3CDS2，也能够显著提高酵母的耐铝毒能力。本发明所述的大豆ABC全转运蛋白GmABCC3可通过基因工程转化到大豆发根和拟南芥中，并最终提高大豆和拟南芥的耐铝毒能力。
中国科学院遗传与发育生物学研究所申请的专利05（发明人：张劲松;韦伟;张万科;陶建军;阴翠翠;陈受宜）公开了种子重量及体积相关的蛋白GmPHD6及其相关生物材料和应用。敲除/降低GmPHD6蛋白质编码基因表达的植株，种子重量或体积明显高于野生型植株。抑制或降低或下调GmPHD6基因表达的物质可用于提高植物种子重量或体积，也可用于植物育种。
中国农业科学院作物科学研究所申请的专利2X（发明人：孙素丽;朱振东;邓东;武文琦;段灿星）公开了与豌豆白粉病抗性相关的KASP标记及其应用。本发明还公开了一个与豌豆抗白粉病抗性相关的SNP位点，该SNP位点为豌豆基因组中对应于序列表中序列4所述DNA分子的第583位脱氧核糖核苷酸，多态性为T/ 。本发明还公开了基于该SNP位点开发的用于鉴定豌豆抗白粉病抗性的KASP标记。通过实验证明：该KASP标记可有效应用于豌豆抗白粉病资源鉴定和豌豆抗白粉病后代群体的分子标记辅助育种，在豌豆生产、育种工作和抗病机理的研究中具有重要价值。
南京农业大学申请的专利74（发明人：徐国华;王婷婷;金毅）公开了一种水稻MYB类转录因子及其编码蛋白的应用。水稻MYB类转录因子基因OsREPLY的序列号为LOC_Os10g33810（Os10g0478300），可在调控水稻株高、倒伏抗性、花期和产量方面应用。本发明通过CRISPR技术手段获得的osreply突变体材料，导致转基因水稻与野生型对照相比发生株高增加、茎秆变粗抗倒伏、花期改变、产量提高。
宁波大学申请的专利78（发明人：孙宗涛;张合红;魏中艳;李雁军;谢凯丽;陈剑平）涉及水稻水杨酸途径重要调控因子OsNPR1基因在植物抗水稻条纹叶枯病中的应用。本发明将全长的OsNPR1基因导入水稻中，并对其进行RSV接毒实验bob.com，获得抗RSV的水稻植株。
华中农业大学申请的专利57（发明人：余四斌;孙;张倩）公开了水稻基因qSS7在调控水稻抗旱能力中的应用。本发明将热带粳稻品种CYPRESS的qSS7基因在籼稻品种珍汕97（ZS97）中超量表达，干旱胁迫条件下qSS7超量表达植株的存活率提高，植株鲜重和干重显著增加，抗旱能力增强；利用分子标记辅助选择将CYPRESS的qSS7基因导入到ZS97中，在干旱胁迫条件下近等基因系的植株存活率提高，植株鲜重和干重显著增加，抗旱能力增强。
福建省农业科学院生物技术研究所申请的专利51（发明人：王锋;朱义旺;;林雅容;陈建民;林艳;张翠军;胡太蛟;陈在杰;陈睿;范美英）提供了水稻Os11g0229500基因及其编码蛋白与应用。通过对Os11g0229500基因进行敲除、沉默或超表达，以调控水稻提前或推迟开花，从而达到调控水稻抽穗期的目的，为优良种植资源的跨维度种植提供条件。同时，通过基因编辑敲除或沉默Os11g0229500基因，可培育得到短生育期的水稻品种。本发明提供的Os11g0229500基因对水稻的抽穗期调控效果明显，经基因编辑成功的株系，与野生型相比，其生育期缩短15到25天，可显著缩短水稻生育期。
南京农业大学三亚研究院申请的专利1X（发明人：宣伟;段星亮;王伟;徐国华;骆乐;瞿红叶）公开了一种水稻器官发育和产量调控基因及其应用。该基因为水稻OsHY1基因第35个碱基之后增加一个碱基A，有利于解析光调控水稻生长发育的机制，及培育水稻高产优质品种，能够应用在调控叶片光合作用、调控水稻株高、调控水稻田间产量及调控水稻根系发育。
宝清北方水稻研究中心和中国水稻研究所申请的专利13（发明人：孙廉平;黄晨博;曹立勇;占小登;彭泽群;程式华;李延慧;周燃;陈代波;刘可可;曹正男;胡博）涉及一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2 InDel。
本发明首次发现了位于水稻第2号染色体上控制粒长的SG2的新等位变异，并获得了可用于区分野生型和突变型的InDel分子标记SG2 InDel。
青岛农业大学申请的专利01（发明人：张玉梅;王会芳;卫喜瑞;陈海龙;付晓凤;李夕梅;郭卫卫）公开了一种调控小麦根毛长度的方法。
本发明使用同源克隆的方法克隆得到TaCSLD3B基因的基因组序列、编码 区核苷酸序列和编码蛋白质的氨基酸序列，并且利用CRISPER/Cas9基因编辑技术系统敲除TaCSLD3B策略验证了TaCSLD3B的生物学功能，TaCSLD3B基因被敲除后将直接影响根毛的生长发育，导致根毛长度显著缩短，根毛数目明显减少。本发明公开了一种与小麦根毛长度显著相关基因TaCSLD3B的分子标记，并进一步开发了相关的引物对。
西北农林科技大学申请的专利59（发明人：曾庆东;刘胜杰;王晓婷;程相瑞;相明杰;穆可卿;吴建辉;康振生;韩德俊）涉及一种小麦抗条锈病基因YrNP63的功能KASP分子标记KASP2683及其应用。所述功能KASP分子标记是根据特异性SNP位点G2683A设计的KASP2683的引物扩增DNA模板所获得的核苷酸序列；所述SNP位点G2683A位于YrNP63编码基因CDS序列的第2683位，SNP位点G2683A的多态性分别为A/G。
YrNP63基因是通过图位克隆的方法从国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）的持久抗病春小麦品种Napo63中发现并克隆的一个全生育期抗条病基因，目前对中国小麦条锈菌流行小种均保持很好的抗性，位于中国春参考基因组1.0版 本的2BS染色体157688966..157696282（ strand）bp位置。本发明通过研究找到了与小麦抗条锈病基因YrNP63共分离的特异性SNP位点 G2683A，并基于特异性SNP位点G2683A开发了YrNP63的功能型KASP分子标记KASP2683。
青岛农业大学申请的专利25（发明人：王会芳;付晓凤;张玉梅;齐彤）公开了一种与小麦苗期侧根数目基因座紧密连锁的分子标记及其应用。
本发明以普通小麦TAA10和人工合成六倍体小麦XX329为亲本及其杂交后自交衍生的包含182个RIL家系为供试材料，利用QTL定位分析，将侧根数目主效QTL（QLrn5D）定位于5D染色体长臂AX 369322708~AX 408656940的区间内。基于双亲TAA10和XX329基因组重测序信息，在QLrn5D区段LOD预测峰值附近设计开发了一个在亲本间有多态性的InDel分子标记QAU5D 735。
四川农业大学申请的专利31（发明人：程怡然;和平鸽;王益;周永红;李思雨;曾建;吴丹丹;沙莉娜;凡星）公开一种控制小麦ZIP3A锌转运功能的氨基酸位点及分子标记。本发明通过单倍型分析、定点突变和酵母功能验证，证实了R227G是控制小麦ZIP3A锌转运功能的新的氨基酸变异位点，并开发了dCAPS分子标记用于该氨基酸变异位点的检测，有效应用于小麦高锌积累品种的辅助选择育种。
西南大学申请的专利82（发明人：潘宇;于菁文;段玲;胡鑫;杜丹;张兴国）涉及的是一种SlHAT5基因及其在番茄抗高温胁迫中的应用。本发明发现番茄HD ZIP家族转录因子SlHAT5基因负向调控番茄对高温胁迫的耐受性，SlHAT5的超量表达可以降低植株的抗高温能力、抗氧化水平，同时参与ABA通路，并在高温胁迫下通过调控以上途径相关基因，提高番茄植株对高温胁迫的敏感性。
沈阳农业大学申请的专利23（发明人：刘玉凤;鹿嘉智;富宏丹;孙周平;齐明芳;李天来）提供了番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用。本发明发现LNT胁迫处理导致番茄叶片中SlPsbS蛋白丰度和NPQ水平下降，而SlCSN5A可与SlPsbS相互作用并促进其泛素化和降解，可用于调控叶绿体内SlPsbS蛋白及其他蛋白的泛素化水平或稳定性。此外，SlCSN5A还参与了CV介导的PsbS降解，并调控番茄对夜低温胁迫的响应。本发明揭示了SlCV和SlCSN5A共同介导的依赖于泛素化的叶绿体蛋白的降解途径。
甘肃农业大学申请的专利18（发明人：廖伟彪;侯雪梅;齐娜娜;李翊华;王桐）涉及SlSR3基因作为负调控因子在提高番茄脐腐病抗性中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄SlSR3基因敲除的突变体，通过观察纯合突变体番茄植株表型、分析突变体的钙含量，发现SlSR3基因能够增加番茄对脐腐病的抗性，而敲除SlSR3基因则会使番茄易感脐腐病，可用于抗番茄脐腐病品种的选育。
北京农学院申请的专利68（发明人：黄煌;王绍辉;乔慧;马吉林;赵文超;孙路路;杨瑞）公开了SlWRKY57基因及其编码蛋白在调控番茄耐盐性中的应用。本发明对SlWRKY57基因进行了基于CRISPR Cas9系统的敲除，得到SlWRKY57基因编辑株系。实验证明，在盐胁迫条件下，SlWRKY57基因编辑植株的萎蔫程度显著降低、鲜重显著增加，表明其对盐胁迫的耐受性显著增加。
山西大学申请的专利52（发明人：王景雪;李欣宇;李晨）为了解决目前高粱醇溶蛋白含量高，消化率低等问题，提供了一种靶向植物醇溶蛋白K2G基因的靶位点编辑序列及其应用。在K2G基因5’端插入该靶位点编辑序列引入突变，通过超声波 花粉介导法将载体转移到高粱植株中，对高粱进行遗传转化。本发明使用CRISPR/Cas9技术，以高粱醇溶蛋白基因K2G为靶标基因，构建一个CRISPR/Cas9基因编辑载体，通过花粉介导的超声波转化法对高粱进行遗传转化，获得醇溶蛋白含量降低、消化率和蛋白质质量提高的高粱突变体株系，为高粱育种工作提供了新的优良种质资源。
中国农业大学申请的专利52（发明人：于静娟;罗威威;刘玉卫）涉及谷子m6A reader SiYTH1在调控植物抗旱能力中的应用。
植物中广泛存在的m6A reader是YTH（YT521 B homology）家族蛋白，其在进化过程中演化出DF和DC两大分支，它们由α 螺旋 β 片层折叠形成一个疏水口袋，形成的疏水口袋中包含2 3个芳香族氨基酸，这是m6A核苷结合所必需的。研究谷子YTH家族蛋白，挖掘可以抵御逆境胁迫的谷子m6A reader，为植物抗逆网络的解析提供新思路，为培育抗逆稳产的作物提供潜在基因资源。
青岛农业大学申请的专利38（发明人：杨洪兵;宋琎楠;于延冲;张弢;董春海）涉及苦荞麦FtIST1基因调控植物耐盐性。苦荞麦FtIST1基因属于SBP转录因子家族，GenBank登录号MK799640。本发明发明利用病毒诱导的基因沉默技术抑制FtIST1基因表达后，苦荞麦耐盐性明显降低；而FtIST1基因过表达可明显改善盐胁迫下拟南芥生理特性，转FtIST1基因拟南芥耐盐性明显提高，确定FtIST1基因与植物耐盐性相关。
中国科学院微生物研究所申请的专利70（发明人：谭华荣;刘翔;张集慧;李月;李金娥）涉及用于检测基因表达的试剂盒及其应用，所述试剂盒可以可视化检测基因表达情况，具体涉及一种基于革兰氏阴性菌酰基高丝氨酸内酯（简称AHL）信号分子群感效应的可视化基因表达报告系统-VRS bAHL及其构建方法和应用。所述试剂盒的特征为：利用革兰氏阴性菌的AHL信号分子合酶基因如cviI等作为报告基因；利用AHL指示菌如CV026等对报告基因的表达进行检测。
先锋国际良种公司申请的专利02（发明人：M·J·弗兰克;郜会荣;J·哈本;S·亨伯特;N·克里希那默西;M·拉斯纳;李柏林;R·B·米利;L·D·佩鲁吉尼;G·M·泰伯;P·J·沃尔特斯）涉及用于使用位点特异性编辑在基因组基因座中对多种天然基因、如抗病基因进行染色体工程化以产生植物的方法。
CTL1存在于1号玉蜀黍染色体上大约5cM的窗口中。为开发复杂性状基因座（CTL）而鉴定的第一玉蜀黍基因组窗口跨越1号染色体上ZM01：12987435（侧翼为公共SNP标记SYN12545）至Zm01：15512479（侧翼为公用SNP标记SYN20196）。一个选择的基因座，疾病超级基因座1(DSL1)，位于1号染色体的远端区，距离复杂性状基因座1（CTL1）大约0.5cM。此距离是专门选择和工程化的，以促进具有插入性状的育种堆叠件，如昆虫控制性状和/或除草剂耐受性状插入CTL1着陆垫并加快产品组装的最终步骤。DSL1在一系列种质（包括一组代表性北美近交系和一系列热带品系）中没有表现主要结构变异的区中的跨越大约3.2cM或515Kbp。在更局部的水平上，泛基因组比对表明该区域的大部分在非硬茎近交系中结构保守。
密苏里大学管理者申请的专利02（发明人：J·瑟伦;M·萨莱）提供了改变植物和藻类中脂肪酸和最终三酰甘油产生的方法和手段。本发明利用生物技术或选择性育种方法下调含生物素/硫辛酰连接结构域（BADC）基因来直接增强ACCase的活性。
植抗公司申请的专利55（发明人：金成龙;申畯惠）涉及一种N 糖基化突变水稻、其制造方法以及利用其的蛋白质生产用水稻的制备方法。本发明获得了对于参与所述植物特异性N 糖基化过程的共8个基因的突变细胞株，并由此确认了医疗用蛋白质的生产可能性，故能够将其有效地用作蛋白质的生产中。
海南波莲水稻基因科技有限公司申请的专利15《一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法》（发明人：黄培劲,安保光,李亚梅,陈思兰,欧阳超）经实质审查后于2017年07月18日以权利要求1-6不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由被驳回。申请人于2017年11月2日向专利复审委员会提出了复审请求。合议组经过审查bob.com，做出了维持原驳回决定的审查决定。今天，就让我们详细看看这个专利。
本发明提供一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法，包括如下步骤：诱导、侵染、共培养、筛选、分化、生根。本发明整个转化流程耗时约70 d，相比常规转化缩短了3个多月，应用该转化方法得到的愈伤诱导率高于85%，平均抗性愈伤率69.71%，平均分化率84.58%，平均转化率约58%。该方法效率高，可操作性强，适于大批量粳稻转基因实验，为水稻基础研究节约了大量时间，同时降低了实验过程中的人力、物力和财力耗费。
国家知识产权局原审查部门于2017年07月18日以权利要求1-6不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织：诱导的培养条件为33℃-14h/30℃-10h光/暗交替培养；
2）侵染：将步骤1）所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于农杆菌悬浮液中侵染，之后晾干待用；
3）共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，培养至愈伤组织表面出现菌体；
4）筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获得抗性愈伤组织；筛选的培养条件为30℃暗培养；
6）生根：将幼苗接种到生根培养基上生根，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株作为转化得到的粳稻植株；
诱导培养基为NLD培养基，其为以NL培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3 mg/L、水解酪蛋白浓度为0.3-0.5 g/L、脯氨酸浓度为1-2 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、植物凝胶浓度为3 g/L，pH值为5.8的培养基；
共培养基为NL-AS培养基，其为以NL培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3 mg/L、水解酪蛋白浓度为0.3-0.5 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、葡萄糖浓度为10 g/L、乙酰丁香酮浓度为100-200 μM，pH值为5.2的培养基；
筛选培养基为NLS培养基，其为以NL培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3 mg /L、水解酪蛋白浓度为0.6-1 g/L、脯氨酸浓度为0.5-1.5 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、植物凝胶浓度为3 g/L、头孢浓度为500 mg/L、潮霉素浓度为50 mg/L，pH值为5.8的培养基；
分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素浓度为1-2 mg/L、α-萘乙酸浓度为0.5-2 mg/L、山梨醇浓度为20-40 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、植物凝胶浓度为3 g/L，pH值为5.9的培养基；
生根培养基为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为20 g/L、吲哚丁酸浓度为0.5 mg/L、植物凝胶浓度为3 g/L，pH值为5.8的培养基；
所述NL培养基为有利于粳稻生长的基本培养基，其为以N6培养基的大量元素、N6培养基的微量元素、L3培养基的有机成分加上铁盐组成的基本培养基；
步骤1）诱导所需时间为9-12 d，步骤3）共培养所需时间为3 d，步骤4）筛选所需时间为20-25 d，步骤5）分化所需时间为25-30 d；步骤6）生根所需时间为2周。”
驳回决定认为：权利要求1与对比文件1（CN1560260A）的区别技术特征为：（1）各种培养基的组分略有差别；（2）各步骤中的参数不尽相同；（3）权利要求1所述转化方法仅由诱导、侵染、共培养、筛选、分化、生根六个步骤组成，而对比文件1所述转化方法除了以上六个步骤之外，还包括继代、预培养、过渡培养和预分化培养。针对上述区别特征（1）和（2），培养基中所含有的常规成分及其含量以及各步骤中培养时间、OD600值等参数，这是本领域技术人员能够通过合理的试验确定的，属于本领域常规技术手段，不需要付出创造性的劳动。针对上述区别特征（3），对比文件1继代和预培养步骤之前已得到愈伤组织，继代和预培养是为了得到更好的愈伤组织；过渡培养步骤之前已得到共培养后的愈伤组织，过渡培养也是为了得到更好的愈伤组织；预分化培养设置在筛选抗性愈伤组织和分化培养步骤之间，预分化培养是为了使抗性愈伤组织进一步更好的分化。继代、预培养、过渡培养和预分化培养是为了使各自上一步骤所得的愈伤组织被更好的培养或分化，故本领域技术人员为了实施快速遗传转化方法，能够想到删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养的步骤，并且删减上述步骤并不会影响后续的实验步骤，其效果也是可以预料的。因此权利要求1不具备创造性。
申请人海南波莲水稻基因科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月02日向专利复审委员会提出了复审请求。
复审请求人认为：（1）权利要求1的NL培养基改进的目的是通过培养基成分的调整，使得省略继代培养、预培养、过渡培养、预分化等培养步骤成为可能，经过反复实验、精细调整，并非有限次实验获得的。对比文件1、2中均没有相关的启示。（2）依据对比文件1说明书第3页最后一段的记载，过渡培养是对比文件1的技术方案能够成功的关键步骤之一，本领域技术人员在对比文件1的基础上能预期省略该步骤会严重影响后续的实验步骤，故而本领域技术人员即使为了实施快速遗传转化方法，也不会在对比文件1的技术方案中省略过渡培养的步骤。本申请经大量实验，发现了OD600值为0.35-0.6时效果最佳，结合30 min的侵染时间，在降低污染率的同时确保了侵染效果，才能够省略“过渡培养”等步骤，节省了这个培养周期。（3）本发明权利要求1和对比文件1相比，将所需的113-165 d缩短到了71-84 d，缩短了1-3个月的时间，对比文件1的转化率仅达到16%。而权利要求1的转化率高于58%，是对比文件1转化率的3倍多，权利要求1取得了预料不到的技术效果。
经形式审查合格，专利复审委员会于2017年11月17日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
合议组于2018年07月25日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：（1）权利要求1所述转化方法仅由诱导、侵染、共培养、筛选、分化、生根六个步骤组成，而对比文件1所述转化方法除了以上六个步骤之外，还包括继代、预培养、过渡培养和预分化培养。（2）各种培养基的组分以及各步骤中的参数不尽相同。针对上述区别特征（1），继代、预培养、过渡培养和预分化培养是为了使各自上一步骤所得的愈伤组织被更好的培养或分化，故本领域技术人员在面对权利要求1实际所要解决的技术问题时，为了实施快速遗传转化方法，能够想到删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养的步骤。针对上述区别特征（2），农杆菌介导的水稻遗传转化方法已成为培育转基因水稻的常规方法，其中所使用的包括诱导、侵染、共培养、抗性筛选、分化、生根转化步骤，培养基以及各步骤的最适条件摸索已经成为本领域的常规技术手段，在对比文件1公开的培养基的基础上作适当调整，对于本领域技术人员来说是容易做到的，不需要付出创造性劳动。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
1）诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；诱导的培养条件为33℃-14h/30℃-10h光/暗交替培养；
2）侵染：将步骤1）所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于农杆菌悬浮液中静置侵染，之后晾干待用；
3）共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，所用共培养基上铺有一层无菌滤纸，培养至愈伤组织表面出现菌体；
4）筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获得抗性愈伤组织：筛选的培养条件为30℃暗培养：
6）生根：将幼苗接种到生根培养基上生根，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株作为转化得到的粳稻植株；
诱导培养基为NLD培养基，其为以NL培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3 mg/L、水解酪蛋白浓度为0.3-0.5 g/L、脯氨酸浓度为1-2 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、植物凝胶浓度为3 g/L，pH值为5.8的培养基；
共培养基为NL-AS培养基，其为以NL培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3 mg/L、水解酪蛋白浓度为0.3-0.5 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、葡萄糖浓度为10 g/L、乙酰丁香酮浓度为100-200 μM，pH值为5.2的培养基；
筛选培养基为NLS培养基，其为NL培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2-3 mg/L、水解酪蛋白浓度为0.6-1 g/L、脯氨酸浓度为0.5-1.5 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、植物凝胶浓度为3 g/L、头孢浓度为50 mg/L、潮霉素浓度为50 mg/L，pH值为5.8的培养基；
分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素浓度为1-2 mg/L、α-萘乙酸浓度为0.5-2 mg/L、山梨醇浓度为20-40 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、植物凝胶浓度为3 g/L，pH值为5.9的培养基；
生根培养基为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为20 g/L、吲哚丁酸浓度为0.5 mg/L、植物凝胶浓度为3 g/L，pH值为5.8的培养基；
所述NL培养基为有利于粳稻生长的基本培养基，其为以N6培养基的大量元素、N6培养基的微量元素、L3培养基的有机成分加上铁盐组成的基本培养基；
步骤1)诱导所需时间为9-12 d，步骤3）共培养所需时间为3 d，步骤4）筛选所需时间为20-25 d，步骤5）分化所需时间为25-30 d；步骤6）生根所需时间为2周。”
（1）在对比文件1的转化率仅达到16%的情况下，为能有效转化，本领域技术人员难以想到删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养这些提高转化率的步骤，本领域技术人员更无法预料通过删减步骤和培养基激素浓度调整，最终能达到58%的转化率。根据对比文件1说明书第3页最后1段的记载，省略过渡培养步骤导致转化的失败，故本领域技术人员即使为了实施快速遗传转化方法，也不会在对比文件1的技术方案中省略过渡培养的步骤。
（2）组培过程中，培养基配方包括不同组份的搭配方式以及组份浓度。已有大量文献证明，培养基组份浓度的微调都会给组培效果带来很大影响。具体到不同植物不同品种，研究人员并不知道何种组合什么浓度会达到想要的效果，只能通过大量的实验，无法用显而易见来概括。而且本申请权利要求1使用所述的培养基组合和对比文件1相比，将所需的113-165 d缩短到了71-84 d，缩短了1-3个月的时间，远远超出本领域技术人员进行培养基、培养条件简单优化时所能达到的效果，具有预料不到的技术效果。
（3）在对比文件1的启示下，权利要求1应限定OD600为1.0-1.2。本申请正是由于OD600值的调整降低了污染率，配合权利要求1培养基组合的改良以及其他环境条件参数的改良，最终使得权利要求1的技术方案中能够省略“过渡培养”等步骤，大大节省了这个培养周期。因此，权利要求1突破了现有技术偏见，具有非显而易见性。
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。在创造性的判断中，判断发明是否具有突出的实质性特点，就是要判断对于本领域的技术人员来说，要求保护的发明相对于现有技术是否显而易见。如果要求保护的发明相对于现有技术是显而易见的，则其不具有突出的实质性特点。
本案中，权利要求1请求保护一种农杆菌介导的粳稻快速遗传转化方法，包括6个步骤，以及各步骤所需的培养基、培养条件或参数、培养时间。对比文件1公开了一种农杆菌介导的粳稻遗传转化方法，包括：
1）诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织13-15天，其中，诱导培养基为：以N6培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）浓度为1.5-2.5 g/L，水解酪蛋白浓度为0.2-0.6 g/L，脯氨酸浓度为0.8-1.2 g/L，蔗糖浓度为40-50 g/L，组织培养胶（即，植物凝胶，phytagel）浓度为2.8-3.0 g/L，pH 5.8-6.0；
2）侵染：将步骤1）所得愈伤组织接种于农杆菌悬浮液中侵染，其中农杆菌悬浮液的OD600为1.0-1.2；
3）共培养：将侵染的愈伤组织转到无菌的滤纸上吸干，再转到共培养基中培养2-4天（实施例培养3天），其中，共培养基为：以N6培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）浓度为1.5-2.0 g/L，水解酪蛋白浓度为0.4-0.8 g/L，脯氨酸浓度为0.4-0.8 g/L，麦芽糖浓度为30-35 g/L，组织培养胶（即，植物凝胶，phytagel）浓度为2.8-3.0 g/L，乙酰丁香酮浓度为100-200 μMbob.com，pH 5.5-5.7；
4）筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后，接种到筛选培养基中进行抗性筛选，持续6-8周，获得抗性愈伤组织，其中，筛选培养基为：以N6培养基为基本培养基，所含2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）浓度为2.0-2.5 g/L，水解酪蛋白浓度为0.4-0.6 g/L，脯氨酸浓度为0.4-0.8 g/L，蔗糖浓度为30-35 g/L，组织培养胶（即，植物凝胶，phytagel）浓度为2.8-3.0 g/L，噻孢霉素浓度为200-300 mg/L，潮霉素浓度为40-60 mg/L，pH 5.8-6.0；
5）分化：将获得的抗性愈伤组织接种到分化培养基上培养2-4周至分化出幼苗，其中，分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，所含激动素（KT）浓度为2.5-3.0 mg/L，α-萘乙酸（NAA）浓度为0.2-0.5 mg/L，麦芽糖浓度为30-35 g/L，组织培养胶（即，植物凝胶，phytagel）浓度为2.8-3.0 g/L，pH 5.8-6.0；
6）生根：将幼苗接种到生根培养基上生根2-3周，其中生根培养基为：以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为10-15 g/L，α-萘乙酸（NAA）浓度为0.2-0.5 mg/L,组织培养胶（即，植物凝胶，phytagel）浓度为2.8-3.0 g/L，pH 5.8-6.0。
权利要求1与对比文件1的区别特征在于：（1）权利要求1所述转化方法仅由诱导、侵染、共培养、筛选、分化、生根六个步骤组成，而对比文件1所述转化方法除了以上六个步骤之外，还包括继代、预培养、过渡培养和预分化培养。（2）各种培养基的组分略有差别：例如：权利要求1基本培养基NL培养基与对比文件1的基本培养基N6培养基在维生素B6和烟酸的浓度上略有差别：诱导培养基中，水解酪蛋白和蔗糖浓度有差别：共培养基中，对比文件1的共培养基中含有麦芽糖作为碳源，而在权利要求1的共培养基中，含有蔗糖和葡萄糖作为碳源，筛选培养基中，在潮霉素和头孢霉素的浓度有差别；分化培养基中，激动素浓度有差别，在权利要求1的分化培养基中含有山梨醇和蔗糖，而在对比文件1的分化培养基中含有麦芽糖：各步骤中的参数不尽相同：例如：步骤2）侵染所用农杆菌悬浮液的OD600值不同，诱导、侵染、共培养、筛选时间不同。
基于上述区别特征，权利要求1实际解决的技术问题是：提供一种农杆菌介导的籼稻快速遗传转化方法，节省转化时间。
针对上述区别特征（1），对比文件1继代和预培养步骤之前已得到愈伤组织，继代和预培养是为了得到更好的愈伤组织：过渡培养步骤之前已得到共培养后的愈伤组织，过渡培养也是为了得到更好的愈伤组织：预分化培养设置在筛选抗性愈伤组织和分化培养步骤之间，预分化培养是为了使抗性愈伤组织进一步更好的分化。继代、预培养、过渡培养和预分化培养是为了使各自上一步骤所得的愈伤组织被更好的培养或分化，故本领域技术人员在面对权利要求1实际所要解决的技术问题时，为了实施快速遗传转化方法，能够想到删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养的步骤。
针对上述区别特征（2），农杆菌介导的水稻遗传转化方法已成为培育转基因水稻的常规方法，其中所使用的包括诱导、侵染、共培养、抗性筛选、分化、生根转化步骤，培养基以及各步骤的最适条件摸索已经成为本领域的常规技术手段，本领域技术人员能够根据各步骤需要达到的效果通过有限的试验确定最适的培养条件，例如就侵染步骤的农杆菌OD值来讲，本领域技术人员已知其既要满足达到一定的转化效率，但同时过高的浓度会造成愈伤污染，因此本领域技术人员能够基于常规使用的OD值的基础上，在能够想到省略过渡培养步骤时，经过有限的试验，在兼顾转化效率以及避免愈伤污染间，确定最适OD600值。就权利要求1所述各步骤培养基而言，基于对比文件1公开的培养基的基础上作适当调整，这对于本领域技术人员来说是容易的，不需要付出创造性劳动。静置侵染、共培养过程中所用共培养基NL-AS上铺有一层无菌滤纸，这些具体操作条件也属于本领域常规技术手段。因此，在对比文件1的基础上结合本领域常规技术手段得到权利要求1的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的，其缩短转化时间的效果是可以预料的。因此，权利要求1的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，权利要求1不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
对复审请求人的相关意见陈述，合议组认为：（1）就本申请删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养步骤而言，继代、预培养、过渡培养和预分化培养是为了使各自上一步骤已经获得的愈伤组织被更好的培养或分化，故本领域技术人员在面对需要节省粳稻遗传转化时间，实施快速遗传转化这一技术问题时容易想到删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养的步骤。在删减上述步骤后相应获得本申请所述的转化时间由对比文件1的113-165 d缩短到71-84 d的技术效果也是本领域技术人员能够预期的。就本申请达到的58%的转化率，对比文件1的16%的转化率而言，与其所转染的DNA片段太大，达到120 kb有关，而且本申请所获得的转化率并非是在仅缺省了上述步骤后带来的预料不到的转化率的提高，其也是在省略了上述步骤后，经过条件的优化，例如培养基、培养时间，侵染菌液浓度等条件的优化后获得的，在农杆菌转化水稻这一技术领域，通过条件优化，提高转化率是常规技术手段，达到本申请58%转化率也是容易实现的。这种技术效果仍然是本领域技术人员可以预期的。对比文件1说明书第3页最后一段记载了两种方法克服农杆菌过度滋生对愈伤组织的污染和危害。其一是噻孢霉素清洗，其二是介入过渡培养步骤，可见这两种方法并非需要同时进行，本领域技术人员为了节省转化时间，容易选择单独采用噻孢霉素清洗的方式而省略过渡培养步骤，同时也会根据省略的该步骤，适当调整培养条件，如在兼顾转化效率的情况下，调整农杆菌浓度以利于农杆菌的去除。
（2）本申请的NL培养基与对比文件1中的N6培养基，仅在维生素B6和烟酸的浓度有差别，即权利要求4中的NL培养基中，维生素B6和烟酸的浓度分别为1.0 mg/L和1.0 mg/L，而在对比文件1的N6培养基中，维生素B6和烟酸的浓度分别为0.5 mg/L和0.5 mg/L。本领域技术人员公知，烟酸和维生素B6具有促进植物愈伤生长的作用，因此，在培养愈伤形成的过程中适当提高其浓度对于本领域技术人员来说也是容易的。就本申请所述的诱导培养基、共培养基、筛选培养基、分化培养基以及生根培养基而言，与对比文件1公开的相应培养也仅仅是个别组分或个别组分的浓度存在差别，并不存在较大程度培养基组分的调整，如共培养基中，对比文件1含有麦芽糖，权利要求1含有蔗糖和葡萄糖作为碳源：在筛选培养基中，仅在潮霉素和头孢霉素的浓度有差别：分化培养基中，激动素浓度有差别，在权利要求1的分化培养基中含有山梨醇和蔗糖。在本领域技术人员容易想到通过删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养步骤，缩短转化时间的情况下，根据各步骤所要达到的效果，在对比文件1公开的培养基的基础上，并不需要太多备选培养基成分即可利用培养基优化的常规技术手段，如单因素、多因素和正交优化实验确定培养基的组分和配比，对于本领域技术人员来说是容易的，并不需要付出创造性劳动。
（3）就侵染步骤的农杆菌OD600值来讲，对比文件1已经给出了明确的教导，依据对比文件1说明书第3页第3段的记载，本领域技术人员能够明了太低的农杆菌菌液浓度导致转化效率下降，但过高的农杆菌浓度会导致愈伤组织的污染和伤害，为后续去除农杆菌增加难度。因此，应当选取适宜的农杆菌浓度。对比文件1选取OD600为1.0-1.2，是基于对比文件1转染的大片段DNA、培养条件以及辅助过渡培养阶段选取的，在本领域技术人员容易想到通过删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养步骤，缩短转化时间的情况下，为了后续更容易去除农杆菌，适当降低农杆菌菌液浓度，在兼顾转化效率以及避免愈伤污染间，经过有限的试验确定最适OD600值对于本领域技术人员来说也是容易的，不存在克服技术偏见的情形。
综上所述bob.com，节省粳稻遗传转化时间bob.com，实施快速遗传转化，省略继代、预培养、过渡培养和预分化培养步骤是本领域技术人员容易想到并且效果也是可预期的。同时本申请针对上述步骤的缺失，所采取的例如培养基、培养时间的调整、农杆菌OD值的选取均是本领域技术人员能够做出的常规调整，所获得的转化率也是基于上述条件的调整后获得的，并非是在仅缺省上述步骤，而不改变其他培养条件后获得的预料不到的技术效果。因此，请求人的意见陈述不具有说服力。
基于以上事实和理由，合议组作出维持国家知识产权局于2017年7月18日对本申请作出的驳回决定的审查决定。
同已有技术相比，有突出的实质性特点（对本领域技术人员来说，非显而易见）和显著的进步（能产生有益的技术效果）的发明才具有创造性。
本发明提供了一种农杆菌介导的粳稻遗传转化方法，该方法通过删减继代、预培养、过渡培养和预分化培养等实验流程实现粳稻快速转化，同时调整培养基配方、培养时间和侵染菌液浓度等条件提升粳稻转化效率。在对比文件1公开方法的启示下，省略上述非关键步骤来缩短转化周期是本领域技术人员容易想到的，技术效果是显而易见的。本领域技术人员公知，根据不同的粳稻基因型通过有限次的正交实验在合理的范围内来优化培养基成分、培养时间和菌液浓度等条件，是可以实现粳稻转化效率提升的。这些均为提高粳稻转化效率的常规技术手段，并且转化率达到58%也是容易实现的。本发明实现的技术效果是显而易见、可以预期的，因此不具有创造性。
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