抗病植物及其培育方法pdfbob.com

　　bob.com未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 15/09申请日:20010907授权公告日:20081001终止日期:20120907授权专利申请权、专利权的转移(专利申请权的转移)变更项目:申请人变更前权利人:日本烟草产业株式会社 申请人地址:日本东京都; 申请人:欣根塔有限公司 申请人地址:英国萨里变更后权利人:日本烟草产业株式会社 申请人地址:日本东京都登记生效日:2007.12.21实质审查的生效公开

　　本发明的研究课题就是提供一种转基因抗病植物并可适当诱导防御反应，以及培育该植物的方法。本发明提供一种表达盒，该表达盒包括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及编码该启动子调控的诱导物蛋白基因。

　　1： 一种转基因抗病植物，其通过使用表达盒进行转化，所述表达盒包 括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及 编码该启动子调控的诱导物蛋白基因，所述植物用于诱导防御反应使有效量 的诱导物蛋白可进行组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型表达。

　　2： 如权利要求1所述的转基因抗病植物，其中所述可使组成型、诱导 型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及编码该启动子调控的 诱导物蛋白基因被整合至基因组中。

　　3： 如权利要求1或2所述的转基因抗病植物，其中所述诱导物蛋白为 对病害微生物具有过敏反应诱导活性的蛋白质。

　　4： 如权利要求3所述的转基因抗病植物，其中所述具有诱导过敏反应 活性的蛋白质选自： (a)由序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b)在序列表SEQ ID NOs：2中，具有一个或数个氨基酸缺失、取代、添加或 插入的氨基酸序列，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者 (c)至少与序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列具有不低于50％的同源性， 且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。

　　5： 如权利要求2所述的转基因抗病植物，其中所述编码诱导物蛋白的 基因选自以下任一DNA中的基因： (a)由序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列组成的DNA； (b)在序列表SEQ ID NOs：1中，具有一个或数个碱基缺失、取代、添加或插 入的碱基序列，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的 DNA； (c)在严谨条件下，与序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列的DNA互补的碱 基序列DNA杂交，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组 成的DNA；或者 (d)至少与序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列具有不低于50％的同源性，且 由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA。

　　6： 一种转基因抗病植物的培育方法，所述植物用于诱导防御反应可使 有效量的诱导物蛋白进行组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型表达， 其步骤包括： (a)利用表达盒获得转基因植物细胞，所述表达盒包括组成型、诱导型、器官 特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及编码该启动子调控的诱导物 蛋白的基因；以及 (b)将该植物细胞再生为植物体。

　　7： 一种表达盒，至少包括： (a)可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子；以 及 (b)编码上述启动子调控的诱导物蛋白的基因； 所述表达盒用于培育转基因抗病植物，该转基因抗病植物在诱导防御反 应中可使有效量的诱导物蛋白进行组成型、诱导型、器官特异型或发育期特 异型表达。

　　8： 如权利要求7所述的表达盒，其中所述诱导物蛋白为对病害微生物具 有过敏反应诱导活性的蛋白质。

　　9： 如权利要求8所述的表达盒，其中所述具有过敏反应诱导活性的蛋白 质选自： (a)由序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b)在序列表SEQ ID NOs：2中，具有一个或数个氨基酸缺失、取代、添加或 插入的氨基酸序列，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质； (c)至少与序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列具有不低于50％的同源性， 且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。

　　10： 如权利要求7所述的表达盒，其中所述编码诱导物蛋白的基因选自 以下任一DNA中的基因： (a)由序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列组成的DNA； (b)在序列表SEQ ID NOs：1中，具有一个或数个碱基缺失、取代、添加或插 入的碱基序列，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的 DNA； (c)在严谨条件下，与序列表中SEQ ID NOs：1所示碱基序列的DNA互补的 碱基序列DNA杂交，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列 组成的DNA；或者 (d)至少与序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列具有不低于50％的同源性，且 由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA。

　　11： 如权利要求7-10中任一项所述的表达盒，其用于培育整体获得性转 基因抗病植物。

　　12： 如权利要求7-11中任一项所述的表达盒，其中所述用于诱导防御反 应可使有效量的诱导物蛋白在病害微生物感染时特异地表达。

　　13： 如权利要求12所述的表达盒，其中包括组成型启动子或器官特异型 或发育期特异型启动子。

　　15： 一种基因，由下面任一DNA组成： (a)由序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列组成的DNA； (b)在序列表SEQ ID NOs：1中，具有一个或数个碱基缺失、取代、添加或插 入的碱基序列，且编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列的DNA； (c)在严谨条件下，与序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列的DNA互补的碱 基序列DNA杂交，且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组 成的DNA；或者 (d)至少与序列表中SEQ ID NOs：1所示碱基序列具有不低于50％的同源性， 且由编码具有过敏反应诱导活性的蛋白质的碱基序列组成的DNA。

　　16： 一种编码下述任一蛋白质的基因： (a)由序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b)在序列表SEQ ID NOs：2中，具有一个或数个氨基酸缺失、取代、添加或 插入的氨基酸序列，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者 (c)至少与序列表中SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列具有不低于97％的同源 性，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。

　　17： 一种下述任一蛋白质： (a)由序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b)在序列表SEQ ID NOs：2中，具有一个或数个氨基酸缺失、取代、添加或 插入的氨基酸序列，且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者 (c)至少与序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列具有不低于97％的同源性， 且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。

　　18： 如权利要求1-5中任一项所述的转基因抗病植物，其为抗二孢白粉 病转基因烟草，该植物通过使用包括组成型或诱导型启动子的表达盒而进行 转化。

　　19： 如权利要求1-5中任一项所述的转基因抗病植物，其为抗稻瘟病转 基因水稻，该植物通过使用组成型启动子的表达盒而进行转化。

　　本发明涉及抗病植物的培育方法，还涉及用于培育抗病植物的基因表达盒以及通过该方法培育出的转基因抗病植物。

　　植物虽然不像在动物中具有常见的免疫系统，但是植物体内确有一种特有的机制可自身防御病原体。例如，高等植物的过敏反应(hypersensitive response，HR)就是，植物感染部位的细胞迅速自融在局部将病原体包围，植物对病原体的侵入产生一种能动的防御性反应。已知这种反应是非亲和的宿主-病原体之间的相互作用以及非宿主-病原体之间相互作用的结果所致而产生的。这里所说的自融(cell suicide)可以看作是局部性程序细胞死亡(Dangl et al.：Plant Cell8：1793-1807(1996))。除了引起HR机制，还诱导其它的防御反应(Hammond-Kosack and Jones：Plant Cell 8：1773-1791(1996))如活性氧(active oxygen species)的产生、细胞壁的加强、植物抗毒素的产生、PR蛋白质等的有关防御蛋白质的生物合成。除了这种局部防御措施外，很多情况下，在植物非感染部位也加大了防御反应如PR蛋白质的积累等，结果导致整个植物体具有防御性。它被称作整体获得性抗性(systemicacquired resistance，SAR)，持续数周或数周以上，整个植物对继发性感染则具有抗性(Sticher et al.：Annu Rev Phytopathol 35：235-270(1997))。

　　植物启动如上所述高度分化地最初防御反应是直接或间接地由侵入的病原体所产生的被称作“诱导物(elicitor)”的分子识别性。而且科学家(Yang et al.：Genes Dev 11：1621-1639(1997))认为作为防御措施的初期反应其中复杂信号逐级扩大是非常重要，所述复杂信号逐级扩大是指植物被感染后迅速产生活性氧或可逆蛋白质磷酸化。所述诱导物分子涉及很多种，它包括所谓的非特异性诱导物(elicitor)，例如寡糖类即很多菌类细胞壁成分壳多糖/脱乙酰壳多糖或葡聚糖的分解产物、或者如植物细胞壁的寡半乳糖醛酸，以及品种特异性诱导物如AVR9等病原菌的非病原性基因产物(Avr基因产物)或者具有中间特异性类型的诱导物如诱导物蛋白(elicitin)等(Boller：Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol46：189-214(1995))。

　　因此，有报告分析，将纯化的harpin通过人工的方法注入或者喷洒于植物体上可诱导细胞过敏死亡或获得性抗性反应(特表平11-506938、Strobel et al.：Plant J.9：431-439(1996)以及Dong et al.：The Plant J.20：207-215(1999))。但是，还没有报道，编码如harpin之类的诱导物蛋白的基因引入植物之后，如何培育转基因植物以及分析该转基因植物。

　　一旦编码如harpin之类的诱导物蛋白的基因被引入植物之后，则植物将把一定量以上的诱导物蛋白进行表达，即使没有病原的正常情况下也是如此；或者在不包括受病原侵害器官的器官上也把一定量以上的诱导物蛋白进行表达，可以想象其结果是，产生各种意想不到的反应，而导致植物不能正常发育。本发明所要解决的技术问题就是提供一种具有转基因抗病植物并可诱导正当防御反应，以及培育该植物的方法。

　　本发明人经过刻苦钻研，发现通过引入Pseudomonas syringae pv.Syringae LOB2-1菌株系的hrpZ基因而转化形成转基因烟草植物，该烟草转基因植物对二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)的接种，产生了类似过敏反应，形成局部坏死斑并获得抗病，进而完成了本发明。尤其感到意外的是，即使使用在整个植物体的细胞中表达的组成型启动子(椰花菜花叶病毒35SRNA基因启动子)表达导致细胞死亡的harpin，所表达的植物也能够正常地发育。并且类似细胞过敏死亡的反应仅仅在病原菌接种之后才被诱导。本发明人又发现引入同样的hrpZ基因转化形成的水稻(rice)转基因植物也获得了抗稻瘟病(Magnaporthe grisea)的抗性，并显示出本研究具有广泛的应用价值。

　　本发明提供一种转基因抗病植物，它能把有效量的诱导物蛋白通过组成型、诱导型、器官特异型、或发育期特异型进行表达，其目的是诱导防御反应，所述转基因抗病植物主要通过使用表达盒进行转化，所述表达盒包括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及由该启动子调控的编码诱导物蛋白的基因。

　　图2所示照片表示在T0代转基因的烟草和水稻中通过Western分析检测harpinpss积累的例子。PC表示作为对照组大肠杆菌表达的harpinpss。

　　图4所示照片表示T1代转化的烟草具有抗二孢白粉病(右面为引入35 S-hrpZ的个体，harpin的表达水平：++，左面为对照的SR1；两者均为接种的第11天)。

　　本发明又提供培育转基因抗病植物的方法，所述转基因植物用于诱导防御反应并能把有效量的诱导物蛋白通过组成型、诱导型、器官特异型、或发育期特异型进行表达。该方法的步骤包括：(a)通过使用表达盒获得转基因植物细胞，所述表达盒包括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子，以及编码该启动子调控的诱导物蛋白的基因；和(b)使该转基因植物细胞再生为植物体。

　　本发明还将提供一种表达盒，它可用于培育转基因抗病植物。该表达盒至少包括：(a)可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子；和(b)编码该启动子调控的诱导物蛋白的基因。

　　所述诱导物是指，引起植物产生防御反应的物质的总称。本发明除了蛋白质之外，还包括重金属离子、病原菌或植物细胞壁成分等。而本说明书中所说的诱导物，除了特殊情况，均为蛋白质诱导物。

　　本发明所说的诱导物蛋白可以是，在即将进行转化的植物中可引起适当防御反应的蛋白质，优选针对病害微生物具有诱导过敏反应活性的蛋白质。因此它包含harpin以及具有与harpin功能相同的harpin样蛋白质。harpin是一种依赖于hrp基因由III型分泌系统注入到植物中的蛋白质。例如，它包括除harpinpss(He et al.Cell 73：1255-1266(1993)以及特表平8-510127)外的harpinEa(Wei et al.Science 257：85-88(1992)以及特表平11-506938)、PopA(Arlat et al.EMBO J 13：543-553(1994))、hrpW蛋白质(Charkowski et al.：J Bacteriol 180：5211-5217(1998))。具有过敏反应诱导活性的蛋白质可以是，如(a)由序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在序列表SEQ ID NOs：2所示的氨基酸序列具有一个或数个氨基酸被缺失、取代、添加或插入并且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者(c)至少与序列表SEQ ID NOs：2所示的氨基酸序列具有不低于50％的同源性(优选不低于80％，更优选不低于90％，再优选不低于97％。)，并且具有过敏反应诱导活性的蛋白质。所述具有序列表SEQID NOs：2所示氨基酸序列的蛋白质是一种新型蛋白。因此，本发明又可提供如下任何一种蛋白：(a)由序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在序列表SEQ ID NOs：2所示氨基酸序列中，具有一个或数个氨基酸被缺失、取代、添加或插入并且具有过敏反应诱导活性的蛋白质；或者(c)与序列表SEQ ID NOs：2所示的氨基酸序列至少具有不低于97％的同源性，并且具有过敏反应诱导活性的蛋白质(但是，从本发明的范围来看，不包括已知蛋白质)。

　　另外，在本说明书中所说氨基酸序列有“一个或数个氨基酸被缺失、取代、添加或插入”的含义是指，通过定点诱变等公知技术方法而被置换等，或者自然发生时有数个氨基酸被置换等。数个氨基酸的意思是指，例如不超过10个，优选不超过3-5个。

　　对于本领域技术人员来说，编码本发明表达盒所用的诱导物蛋白质的基因可以根据常规方法很容易分离得到。

　　所述编码诱导物蛋白质的基因可以为如下所示碱基序列的DNA分子：(a)由序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列组成；(b)在序列表SEQ IDNOs：1所示碱基序列中具有一个或数个碱基被缺失、取代、添加或插入并且编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列；(c)在严谨的条件下，与序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列杂交且编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列；(d)与序列表SEQ IDNOs：1所示碱基序列的DNA至少具有不低于50％的同源性(优选不低于80％，更优选不低于90％，再优选不低于97％。)并且还编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列。所述具有序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列的DNA为新型DNA。因此，本发明又提供如下任一DNA分子组成的基因：(a)由序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列组成；(b)在序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列中具有一个或数个碱基被缺失、取代、添加或插入并且编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列；(c)在严谨的条件下，与序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列的DNA互补的碱基序列杂交且编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列；(d)与序列表SEQ ID NOs：1所示碱基序列的DNA至少具有不低于50％的同源性(优选不低于80％，更优选不低于90％，再优选不低于97％。)并且还编码具有过敏反应诱导活性蛋白质的碱基序列(但是，从本发明的范围来看，不包括如Pseudomonas syringae pv.Syringae 61菌株系的hrpZ基因等已知的基因)。另外，关于碱基序列的同源性的计算可以使用市售的软件。

　　在本说明书中所说碱基序列有“一个或数个碱基被缺失、取代bob.com、添加或插入”的含义是指，通过定点诱变等公知技术方法被置换，或者自然发生时有数个碱基被置换等。数个碱基的意思是指，例如不超过10个，优选不超过3-5个。本说明书中所说的严谨条件是指，温度约为40℃以上，盐浓度约为6×SSC(1×SSC＝15mM柠檬酸钠缓冲液；pH7.0；0.15M氯化钠；0.1％SDS)，优选温度约为50℃以上，更优选约65℃以上的杂交条件。

　　本发明所使用的启动子可以是具有基因启动子功能的启动子，所述基因启动子在转基因植物中作为编码诱导物蛋白的基因启动子。本发明可以使用的启动子为可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子。

　　所说可使发育期特异型基因表达的启动子(有时也称作发育期特异型启动子)是指，在转录时赋予发育时期的特异性，如所述发育期包括发育初期、中期和后期等。发育期特异型启动子包括：例如，在SAG12启动子(Gan and Amashino：Science 270：1986-1988(1985))这样老化叶子中特异性表达的启动子。

　　本发明表达盒中用于亚克隆各主要DNA片断的载体可按照本领域常规方法将所要的基因连接入载体重组(质粒DNA)从而可方便地制备出用于所使用的载体，但不限于此例，具体地包括：来自大肠杆菌的质粒，例如，pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322。

　　为将本发明表达盒引入到目标植物中的载体优选使用用于植物转化的载体。所述用于植物的载体并不作特殊的限定只要它能够在植物细胞中进行表达它所应表达的基因而且还具有生产相关蛋白质能力的均可，比如，pBI221、pBI121(Clontech)以及由它们衍生的载体。另外，尤其是单子叶植物的转化可举例为，pIG121Hm、pTOK233(均为Hiei等，PlantJ.，6，271-282(1994))、pSB424(Komari等bob.com，Plant J.，10，165-174(1996))，超双元载体pSB21以及由它们衍生的载体等。本领域技术人员通过已知的方法将编码诱导物蛋白的基因引入(必要时，可重组启动子区域)到那些已知的载体上进而可构建包含有本发明表达盒的重组载体。例如，通过把hrpZ基因重组到超双元载体pSB21上则可构建包含组成型启动子和hrpZ在内的表达盒的重组载体。从该重组载体除去已有的启动子，再通过重组诱导型启动子则可构建包含诱导型启动子和hrpZ在内的表达盒的重组载体。

　　用于植物转化的载体优选，至少包括启动子、翻译起始密码子、目的基因(本发明的DNA序列或其部分序列)、翻译终止密码子以及终止子。另外，还可适当包括，如编码信号肽的DNA、增强子序列、目的基因的5′和3′侧的非翻译区、选择标记区。所述标记基因，除了以下抗生物质的抗性基因外如，四环素、氨苄青霉素、或卡那霉素、或新霉素、潮霉素或大观霉素，还包括，虫荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)等。

　　得到的转化细胞可以根据适当标记物作为指标或者根据是否已表达所要的性状从而在其它的细胞中进行筛选。进一步地，通过利用现有技术使之再生，则能得到所要的转基因植物。

　　得到的转化体可以根据本领域技术人员所周知的各种方法进行分析。例如，以引入的基因DNA序列为基础合成寡核苷酸引物，用该引物通过PCR法可以分析转基因植物的染色体DNA。还可分析与引入的基因相对应的mRNA或者有无蛋白质表达。更进一步地还可分析植物体的外观(如，当引入编码产生局部坏死斑的蛋白质基因时，是否出现局部坏死斑或其坏死斑的大小、数目等)、抗病(如使植物体与病原菌接触时有无抵抗能力、或其抵抗程度)等。

　　在本发明转基因植物中，用于诱导防御反应可使有效量的诱导物蛋白质进行组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型表达。所说用于诱导防御反应的有效量是指，所表达的诱导物蛋白的量可使植物至少在其局部可引起有关防御反应(例如，细胞过敏死亡(局部坏死)的诱导)。优选有效量为，防御反应不仅仅是在局部，而是在整个植物体中的量，其结果就是遍布整个植物体(整体获得性抗性)。另外还优选当局部坏死斑达到非常大的程度时，该有效量不能超过坏死斑的局部组织枯死的量。

　　在本发明转基因植物中，优选诱导物蛋白质的有效量表达的标准为，通常由于不表达或者即使表达其表达量也很低且正常条件下明显不妨害植物生长的发育，当植物受到病原菌侵害刺激时则诱导产生防御反应。例如，当诱导物蛋白质为harpinpss时，通常，harpinpss不表达或者即使表达产生的局部坏死斑也不至于使植物体的器官枯死。当病原菌侵入时，优选harpinpss的基因表达量足以引起过敏反应。进一步优选harpinpss的基因表达量为即使病原菌侵入并积累了harpinpss又无法用肉眼观察到局部坏死斑，但是，整个植物体已具有抗病。

　　为了诱导上述的适当防御反应，例如，则应使用可诱导型基因表达的启动子。因此，在本发明的一种实施方式中，采用诱导型启动子和harpin基因联合进行表达。

　　为了达到适当防御反应除了使用诱导型启动子外，还可使用组成型启动子。因此，在本发明其它实施方式中，采用组成型启动子和harpin基因联合表达的方式。此时，作为产生适当防御反应的机理，例如，可推测harpinpss等的蛋白质虽然在植物细胞的细胞膜外或细胞壁上被识别，即使细胞质内积累了harpinpss蛋白，但在真菌侵入导致细胞破裂之前是无法识别植物细胞，其结果是，病原菌接种后产生过敏反应，或者在harpinpss的诱导活性上是否存在着引起病原菌接种的其他什么因素。

　　本发明转基因植物包括，抗二孢白粉病的转基因烟草，该烟草通过使用表达盒而进行转化，所述表达盒包括组成型或诱导型启动子、编码由该启动子调控的如harpinpss的诱导物蛋白的基因；转基因植物还包括抗稻瘟病转基因水稻，该水稻通过使用表达盒而进行转化，所述表达盒包括组成型启动子、编码由该启动子调控的如harpinpss的诱导物蛋白的基因。

　　本发明除了下面实施例所记载的烟草、水稻之外，还适用于其他植物，这些植物包括农作物，例如小麦、大麦、黑麦、玉米、甜菜、高粱、棉花、向日葵、花生、番茄、马铃薯、甘薯、豌豆、大豆、赤豆、莴苣、卷心菜bob.com、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜青、萝卜、菠菜、洋葱、胡萝卜、大蒜、茄子、南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、草莓、葡萄等；观赏植物包括，例如拟南芥、矮牵牛、菊花、康乃馨、非洲紫罗兰、百日菊。另外，本说明书中所说的“转基因植物”都是通过本发明方法获得重组植物细胞，再通过该重组细胞再生为植物体以获得转基因植物的T0代，所说转基因植物不仅包含T0代，还包含由该T0代转化而得的后代(T1代)植物，然而只要保持抗病的性状均可称为本说明书中所说的“转基因植物”。还有，除了特殊描述之外，在本说明书中所说的“植物”，除植物体(个体)，还包括种子(包括发芽种子、未成熟种子)、器官或器官的一部分(包括叶、根、茎、花、雄蕊、雌蕊、以及它们的一部分)、植物培养细胞、愈伤组织、原生质体。

　　在下面实施例中分析的植物病害包括烟草的二孢白粉病和水稻的稻瘟病，但是作为烟草的其它病害还包括，野火病、细菌性萎焉病、TMV等，而作为水稻的其它病害还包括，鞘疫病(sheath blight disease)、细菌性叶疫病等，由本发明培育抗病植物的方法能够充分地赋予这些病害的抵抗能力。实施例

　　使用限制性内切酶BamHI、SalI消化上述的质粒，该质粒hrpZ基因整合入pCR2.1而成，0.7％琼脂糖凝胶电泳分离约1.1kb的片断。将该片断与用同样的酶进行消化的表达载体pQE31(Qiagen)进行连接，并转入到大肠杆菌M15菌株内。将所述大肠杆菌用LB培养基37℃在1mMIPTG存在下进行培养，积累harpinpss的不溶性级分。但是，这种蛋白质在镍树脂载体上吸附性很差，因此harpinpss的纯化按照下述步骤进行：用含有氨苄青霉素(100mg/l)、卡那霉素(25mg/l)的LB培养基(2ml)37℃下过夜培养大肠杆菌M15菌株，该菌株包含由Hrp基因整合到pQE31上的载体，然后将菌株转移到250ml的LB培养基中再培养约3个小时，加入1mM IPTG，进一步在37℃下培养4个小时。离心收集细胞，用不溶性级分溶于4ml洗脱液(8M尿素、0.1M磷酸二氢钠、0.01MTris、pH8.0)，离心分离取上清液，用含有0.1％SDS的12.5％聚丙烯凝胶电泳，再用考马斯亮蓝染色，切出40kDa附近出现的染色带。将凝胶切碎，加入10倍于凝胶容积的洗脱溶液(1％SDS、0.02M Tris-HCl、pH8.0)震荡3天。将上清液移至级分分子量为6,000-8,000的透析膜上，80％的丙酮作为外液进行透析1次透析需4个小时，过夜仅透析1次。把透析管内所有溶液移入到微量离心管中，离心去掉上清液，片状沉淀物在速干袋里快速干燥得到了纯化的harpinpss制品bob.com。将相当于3mg的纯化harpinpss邮寄到Sawady技术公司，委托制备抗体(抗兔harpinpss血清)。实施例3  基因的构建和植物的转化

　　使用限制性内切酶XbaI、SacI(宝酒造)消化将整合的pCR2.1的hrpZ基因自载体切割下。另一方面，使用相同的酶消化超双元载体pSB21(35S-GUS-NOS，Komari et al.，Plant J.10：165-174(1996))，除去GUS基因，再将hrpZ基因重组到经过消化的超双元载体。按照以上步骤，构建35S-hrpZ(35S启动子-hrpZ基因-NOS终止子)构建体。花椰菜花叶病毒35S启动子是一种高度表达的组成型启动子，推测通过使用该构建体转化的水稻和烟草使它们整个植株都积累了hrpZ基因产物-harpinpss。

　　根据叶盘转化法(Horsch et al.，Science，227，1229-1231(1985))转化烟草。把温室内培育的烟草品种SR1的叶子用70％的酒精消毒30秒，然后再用稀释5倍的安替拂民消毒5分钟，用灭菌水洗涤2次后，切取约1cm大小的叶片，使之接种土壤杆菌的悬浮液。转化苗的诱导筛选时以及生根时的潮霉素浓度分别为50或100mg/ml、0或50mg/ml。按照转基因水稻的方法(Hiei等，Plant J.，6bob.com，271-282(1994))介导土壤杆菌转化源于水稻品种“月之光(Tsukinohikari)”和“Koshihikari”的未成熟胚的愈伤组织。实施例4转化体的分析  (1)  转基因烟草

　　分别得到15个35S-hrpZ再生植株，10个PALS-hrpZ再生植株和16个PALL-hrpZ再生植株。在这些转基因植物中没有观察到明显的转化率差异。用Western分析当代(primary generation)(T0)的重组体，在重组体经自我繁殖产生的后代T1代中进行了Western分析和病害的检测。

　　蛋白质的表达水平可用4个阶段(+++、++、+、-)表示，它们各自总的可溶性蛋白质超过0.1％时则表示为(+++)，在0.05-0.1％之间则表示为(++)，低于0.05％时则表示为(+)，低于检测界限时则表示为(-)。后述表2、3和4相同。

　　当包含PAL启动子的构建体则80％以上的个体可检测出harpinpss的积累。另外，如所预想的，PALL比PALS高度表达(++)的个体所占比例大。另一方面，当包含35S启动子的构建体则在15个个体中有harpinpss的积累，虽然有6个个体完全没有积累harpinpss，但是获得了近半数的7个高度表达的个体。而且这其中有6个个体显示出蛋白质表达极高(+++)。更有趣的是在这些高度表达的个体中其植物的叶、茎、根或花器官中没有看到形态学上的变化，而且种子的育性几乎都是正常的。

　　选定T0代中harpinpss积累量高的烟草个体，得到自我繁殖后代(T1)的种子。把种子播种下去，连续观察约2个月左右，但在这段时间里没有看到形态学上的变化，同T0代的发育一样为正常发育，而且在叶表面上也没有看到过敏反应。然后又对4-5叶子期的转化烟草的T1代进行二孢白粉菌的喷雾接种，试测其抗病。用约2L的1.4×106孢子/ml二孢白粉菌孢子悬浮液喷雾播种于244个重组个体及4一个原品种个体之上。其结果是，接种后4或5天时在重组体的下部叶子上诱导出过敏反应样的局部坏死斑(图3A、B)。更惊人的是不仅仅PAL-hrpZ，在包含组成型启动子的35S-hrpZ构建体中，也诱导出病原菌感染后特异性出现局部坏死斑(图3B)。病原菌接种后的第5天局部坏死斑的出现频率在非重组体中为5％左右，而在35S-hrpZ构建体中是非重组体的6-14倍(30-71％)，在PAL-hrpZ重组体中是非转化体的4-5倍(20-27％)(表2)。其后，在PAL-hrpZ重组体中局部坏死斑的数目逐渐增加。推测PsPAL1启动子可能是与二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)发生反应的原故。harpinpss积累量和局部坏死斑的形成成正向关系(表3)，至少在我们进行的Western分析重组体个体中没有检测到harpinpss的积累，而这种局部坏死斑的发生是个例外情况。

　　为了研究在感染二孢白粉菌后所发生的局部坏死斑与抗病之间是否有存在着关联性，发明人研究了接种后第11天感染二孢白粉病的病状。研究结果表明，在非重组个体中没有二孢白粉菌丝生长受到抑制的现象，相反在35S-hrpZ构建体中有15-57％的个体，在PAL-hrpZ构建体中有13-18％的个体比非重组个体明显看到了轻微病状(图4，表2)。不仅仅是产生局部坏死斑的叶子就是不产生局部坏死斑的中部叶子至上部叶子其二孢白粉病蔓延也得到控制，认为这是整体获得性抗性(SAR)的作用。用棉染蓝染色观察二孢白粉菌的菌丝时，作为对照的原系统SR1患病叶其二孢白粉菌的菌丝在旺盛生长的叶表面上扩大，相反虽然在转化体叶表面上形成吸器，但其菌丝生长受到抑制，结果菌丝生长停止。本研究所使用的启动子为35S(组成型启动子)和PAL(诱导型启动子)，使用35S比使用PAL时局部坏死斑出现的频率高，而且至少在接种后第11天的研究中，获得许多高抗病个体(表2)。但是，当使用35S启动子时，在一些个体中与病原菌反应形成的局部坏死斑变得非常大(占叶表面的10％以上)，而且还观察到植株下部的叶子枯死掉。还有，即使在harpinpss积累的个体中有时用肉眼也观察不到局部坏死斑(表2)，像这样的个体就具有二孢白粉病抗性(在表2局部坏死斑(-)个体中，表示括号内的个体数。harpinpss表达水平均用++表示)。认为有可能是在非常微小的范围内发生了过敏反应。通过筛选这样的个体认为可以获得应用价值很高的抗病植物。在组成型启动子中控制转录hrpZ时没有病原菌的侵入则不产生局部坏死斑，该现象是由于harpinpss在植物细胞的细胞膜外或细胞壁上被识别，在细胞质中积累的harpinpss在直到引起细菌侵入而细胞破坏之前都不被植物细胞所识别，可以推论接种病原菌后产生了过敏反应。或者也许是在harpinpss的诱导活性上存在某种导致病原菌接种的因子、或者存在来自病原菌或植物以及其它什么因子、或者是该诱导活性需要诱导。

　　(其中为个体数缓慢的个体数)            生的比例(接种    的个体比例(接

　　局部坏死斑产生数量的关系harpinpss的表达水平a   局部坏死斑产生的程度b        局部坏死斑产生频率(Western分析)

　　把harpinpss引入“月之光”品种。获得35个35S-hrpZ再生植物个体和26个PPDK-hrpZ再生植物个体。在这些构建体中没有看到转化率之间有明显差异。对转化当代(T0)进行Western分析，筛选出高表达的个体。

　　用与上述烟草同样的方法提取再生的转基因水稻品种(月之光)的蛋白质，并进行Western分析，T0代的Western分析结果如表4所示。

　　水稻“月之光”同烟草的情形相同并获得了高表达harpinpss的个体(参照图2)。包含35S-hrpZ启动子的构建体约半数个体检测出harpinpss的积累，尤其是高表达个体(++)的比例超过全部的1/3。包含PPDK-hrpZ启动子的构建体约2/3的个体中检测出harpinpss的积累，其中有4个个体是高表达的。更有趣的是在这些高表达个体的叶、根或花器中没有观察到形态学上的变化。另外，其种子的育性也几乎都是正常的，因此可以获得高表达个体的T1种子。

　　在引入35S-hrpZ构建体T0代的个体中，筛选其中harpinpss积累量非常高(表5中的+++)的4个个体(hrp5-8、hrp23-5、hrp24-1、hrp42-9)然后研究它们T1代对水稻稻瘟病的患病程度。所选定的4个高表达个体的种子育性是正常的，可获得很多自我繁殖的种子。把T1种子按照8粒×2行播撒在装有培植土的苗盆里，温室培育，当叶子长到4.8-5.2叶片时，鉴定叶片染病情况。水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)使用的是007小种(race)。在麦片-蔗糖琼脂培养基上接种培养稻瘟病菌(28℃、黑暗条件下)，菌落蔓延后，使用25℃下的近紫外光照射形成的分生孢子。用0.02％的Tween20调整悬浮液(1.5×105个分生孢子/ml)，在每3个苗盆中喷雾30ml悬浮液以进行稻瘟病菌的接种。经过喷雾接种的水稻在温度为25℃，湿度为100％的条件下，于加湿恒温仪内保持24小时，然后移入到温室内。温室的设定条件是，25℃光照16个小时，22℃暗处8个小时。接种6天后目测接种时最上部的展开叶子(第5片叶)对进展性病斑进行计数。其计数结果可通过Mann-Whitney U鉴定进行显著性差异的检测处理。

　　其结果，通过稻瘟病菌的接种并没有观察到局部坏死斑，但是在引入harpinpss的4个水稻系中，其中3个水稻系(hrp5-8、hrp42-9、hrp23-5)与对照组Koshihikari相比其平均进展性病斑数目减少了24-38％。而且这种减少是统计学上显著性的减少(表6)。以上结果显示，通过引入harpinpss可以增强水稻的抗病能力。

　　对水稻稻瘟病的病性鉴定结果株系               供试个体数    平均进展性病斑a(标 显著性差异的检测b

　　本发明首次发明了将编码harpin的基因连接于组成型启动子或诱导型启动子并引入植物中可赋予该植物的抗病。除阐明引入harpin的植物中蛋白质性质诱导物-harpin的作用机理外，还对局部或整体获得性抗性的原理作了进一步的阐明。另外，过去曾认为如果不使用诱导型启动子则很难培育出抗性植物，而通过培育引入harpinpss抗性植物表明即使使用组成型启动子也能培育出抗病植物，其适用范围广泛，而且还显示了本研究课题的广泛性。本发明提供的培育抗病植物的方法是通过将编码harpinpss的DNA序列整合至表达盒，再引入植物细胞中从而获得再生植物，所述表达盒包括如下序列：在植物细胞中可发挥作用的适当的组成型、器官特异型·发育期特异型或者由环境胁迫或病虫害诱导的启动子序列，以及在植物细胞中可发挥作用的终止子序列，在本发明中已经显示出该研究课题在遗传工程学上的有效性和可行性。

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　　本发明的研究课题就是提供一种转基因抗病植物并可适当诱导防御反应，以及培育该植物的方法。本发明提供一种表达盒，该表达盒包括可使组成型、诱导型、器官特异型或发育期特异型基因表达的启动子以及编码该启动子调控的诱导物蛋白基因。 。