第八章——植物bob.com细胞培养

　　bob.com（一）次生代谢和次生代谢产物 植物次生代谢产物种类繁多，已经分离、鉴定的有10 万个左右，按结构特点可分为苯丙素类、醌类、黄酮 类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七大类。详 细情况可参阅《中药化学》、《天然产物化学》等书。

　　植物次生代谢产物的重要性：色素、香料、药物与保健品、食 品添加剂、化工等重要原料等。全球2/3的药物直接或者间接 来源于植物次生代谢产物（天然产物、天然药物）。 1. 从植物中提取：可靠，但受到资源的限制，bob.com会破坏野生资 源；人工栽培则占用土地、受病虫害、自然灾害等因素的限制。 2. 化学合成：产量高、成本低，但污染环境，而且有些物质 结构复杂，难以人工合成，如海南粗榧内酯；有些虽然可以人 工合成，但成本太高，如紫杉醇等。

　　在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离 子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作 为稳定PH的一种方法。

　　二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中， 二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。

　　一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养液加入到2份8%三氯化铬溶液中，在 70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用 血球计数板进行细胞计数。 2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻 度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。

　　(4) 培养方式：采用看护培养（nurse culture）是降 低最低起始细胞密度的有效方法之一。 看护培养（nurse culture）：将亲本愈伤组织或高 密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密 度细胞生长、分裂的培养方法。

　　叶组织是分离单细胞的最好材料， 1、机械法：叶片组织轻轻研碎，匀浆过滤或离心，得到纯化 细胞。 特点：细胞不受酶伤害，不会发生质壁分离。不适用于所有 植物 2、酶解法：利用果胶酶处理叶片，使细胞间的中胶层发生降 解，分离出具有代谢活性的细胞。 特点：必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞胀裂。

　　平板培养的效果，可用植板率（plate efficiency） 来衡量。 植板率（%）=每个平板中新形成的细胞团数/每 个平板中接种的细胞数×100

　　(1) 植物种类：生长快、容易培养的植物（如大 多数草本植物），其植板率高；相反，则低。 (2) 细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种， 则植板率高。 (3) 接种细胞密度：接种密度高，有利于细胞分 裂，提高植板率，如烟草细胞。

　　• 在运动的液体培养基中培养细胞。又称悬浮细胞培养 （ suspension cell culture）。细胞是分散的，可以长期 培养。

　　有2种形式： 成批培养(batch culture)：一个容器的细胞培养结束后，细 胞被转移到新的容器中继续培养。 连续培养(continuous culture)：在一个容器（或者系统）中 连续不断的培养植物细胞。

　　(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条 件化培养基，植板率高。 (5) 培养方式：采用看护培养（nurse culture） 是可以提高植板率。 平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法

　　• 建立起来的悬浮细胞必须适时进行继代培养。 • 继代培养（传代培养；subculture）：将培

　　养物（芽、愈伤组织、细胞等）分成若干份， 接种到新鲜培养基上继续增殖的过程。

　　• 在悬浮培养中，细胞刚进入静止期之初，细胞悬浮液达到 最大量，就必须进行继代培养。因为处在静止期的细胞悬 浮液保存时间太长会引起细胞的大量死亡和解体。

　　(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植 物），其最低起始细胞密度比较低；相反，则高。 (2) 细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则起始细 胞密度可以比较低。 (3) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条件化培养基 (conditioned medium)培养细胞，起始细胞密度低。 条件化培养基:培养过几天高密度细胞后的无细胞培养基。

　　• 利用大规模细胞培养技术可以在室内生产一 些植物细胞合成的有用物质，如色素、香料、 药物成分等。

　　在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、适合 悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法是： （1）从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的 浅色愈伤组织。 （2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。bob.com （3）接种在固体培养基上培养2周。 （4）挑选生长快的细胞株并继代培养。 （5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛 选出有效成分高而生长较快的细胞株。

　　3. 植物细胞大规模培养：植物细胞具有形态全能性，化学全 能性（在离体条件下可以合成整株植物能合成的物质）。

　　优点：不破坏、不依赖野生资源，不受环境因素的影响，环境 污染小，不占用土地资源，产量可以调控等，所以是一种很有 前途的方法。

　　细胞悬浮培养要求达到一定的接种细胞密度 (cells/ml)， 一 般为0.5-2.5×105个细胞/ml。密度高，细胞分裂快，延滞期 短；密度低则相反。如果密度太低，细胞易凋亡，导致培养 失败。因此，bob.com悬浮细胞培养时，要求达到最低起始细胞密度 （minimum initial cell density）。

　　• 单细胞培养是培养彼此分离的单个细胞，是 研究和观察细胞生长与分裂过程的有效方法。

　　一、微室培养(Culture in microchamber) 微室培养是在悬滴培养的基础上发展而来的。 1955年DeRopp把含有细胞的液体培养基滴在玻璃板上以观测单细 胞的生长。但他没有发现单细胞分裂，发生分裂的是含有几个细胞的 小细胞团。 1957年，Torrey改进了培养方法，采用微室培养。利用此培养技术 培养豌豆根尖单细胞，得到了含几个细胞的细胞团。 1960年，Jones用条件化培养基在微室中进行悬滴培养烟草杂种细胞， 得到了含30个细胞的细胞团，并用录象记录了细胞分裂的全过程。

　　(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植 物），其最低起始细胞密度比较低；相反，则高。 (2) 细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则起始细 胞密度可以比较低。 (3) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条件化培养基 (conditioned medium)培养细胞，起始细胞密度低。 条件化培养基:培养过几天高密度细胞后的无细胞培养基。

　　• 为了加速细胞增殖，有的甚至在对数生长期末就进行继代。bob.com 最适的周期一般为1-2周。但实际所需的时间和接种量应 视不同细胞系而定。

　　• 继代时间为1周的细胞系可用1：4的接种量，继代时间为 2周的可用1：10的接种量。

　　1、培养基成分： N6，MS，B5适合单子叶植物细胞， MS，B5，LS，SL适合双子叶植物细胞。 条件培养基适合单细胞和低密度细胞培养。需要硝态 氮、铵态氮、无机磷浓度更高。

　　1）细胞生长速度较快； 2）可以长期、连续、大规模培养细胞； 3）不能跟踪单细胞的分裂和生长过程。

　　1. 进行细胞生物学研究： 通过适当的培养技术，人们可以连续观察和记录（摄像）

　　单个细胞的生长、分裂和分化的全过程。因此，bob.com细胞培养技 术是研究细胞生长、分裂和分化的良好实验体系。

　　植物细胞大规模培养生产次生代谢物质一次生代谢和次生代谢产物植物次生代谢产物种类繁多已经分离鉴定癿有10万个左右按结极特点可分为苯丙素类醌类黄酮类单宁类萜类甾体及其甙生物碱七大类

　　• 概念： 在培养基中培养彼此分离的细胞、使之Βιβλιοθήκη Baidu长、 增殖或分化。 包括固体培养和液体培养2种形式。

　　2. 培养基制备 配制固体培养基，但浓度要比正常的高（与稀释 倍数有关），高温灭菌后冷至35-40℃。 条件化培养基的配制：培养悬浮细胞的培养液→ 离心→取上清液→与高温灭菌的培养基等量混合 →冷至35-40℃备用。

　　3. 平板培养的制作： 将单细胞悬浮液按预定的比例与35-40℃固体培养基混 合均匀后，倒入无菌培养皿中，培养基的厚度为5 mm 左右。盖上盖子，摇动、布匀，用Parafilme膜封口后， 进行培养。（或放入垫有湿润无菌滤纸的大培养皿中， 以防水分的蒸发过快）。

　　如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化 的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是 怎样影响这些过程的？

　　• 细胞培养：效率高。先诱变细胞，再将细胞培养在 有选择压力的培养皿中，具有抗性的细胞就可以分 裂，诱导其形成完整植株，即可获得抗性变异体。 在一个培养皿中，一次可以筛选10-20万个细胞 （一个细胞就是一潜在的植株）。

　　（一）初生代谢和初生代谢产物 初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢， 如呼吸作用、光合作用、蛋白质和氨基酸代谢、核酸 和核苷酸代谢、脂肪代谢、激素代谢等。 初生代谢产物：初生代谢过程中形成的各种产物。初 生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。

　　（一）次生代谢和次生代谢产物 次生代谢：对植物正常的生长发育非必需的代谢，其代谢 产物称为次生代谢产物。次生代谢是在初生代谢基础之上 衍生而来的。 次生代谢产物为小分子有机化合物，其产生和分布通常有 种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，也往往是 末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。

　　起始密度：细胞培养最低的有效密度，即能使细胞分裂、增 殖的最低接种量，低于这个密度细胞不能分裂，甚至很快解 体死亡。

　　3、植物生长调节剂：细胞悬浮培养时，常表现一种自然的聚 集现象，加入2，4-D，少量水解酶或酵母提取液，能够增加 细胞的分散度。

　　3、细胞鲜重和干重： 4、细胞有丝分裂的指数：在一个细胞群体中，处于有丝分裂 的细胞占细胞总数的百分数。 5、细胞植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细 胞总数

　　1. 悬浮细胞生长的特点 在一个细胞培养周期中，细胞的生长情况经历了慢—快—慢 的过程。 细胞培养周期：两次继代培养所间隔的时间。

　　• 在固体培养基中培养细胞=静止培养。细胞被固定、 不能移动；单细胞分裂后形成细胞团。

　　优缺点: 1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和 生理特性具有一致性； 2）细胞生长速度较慢； 3）不能长期、连续、大规模培养细胞。

　　• 1960年Bergamann首创，是在固体培养基 中培养大量单细胞的一种方法。

　　1.单细胞悬浮液的制备： （1）用不锈钢滤网（150 μm )过滤快速生长期（旺盛 分裂）的悬浮细胞，得到单细胞滤液； （2）滤液经过离心后， 细胞沉淀； （3）倒出上清液，用新鲜培养基重新悬浮细胞，并调 节细胞密度（视最终接种密度和固体培养基混合的比 例而定；一般5×103-5×105 cell/ml）